云南核桃無(wú)融合生殖率和果實(shí)生長(zhǎng)量研究

熊利權(quán) 寧德魯 石卓功 肖良俊 吳 濤 楊從華

( 1. 西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650233；2. 云南省林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明 650201)

核桃（Juglans regia）又名胡桃、羌桃，是我國(guó)重要的栽培經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種，屬胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（Juglans）多年生高大落葉喬木[1-2]。云南核桃以深紋核桃為主，因有得天獨(dú)厚的自然條件和悠久的栽培歷史，云南核桃種類多、品種雜，構(gòu)成了多樣、復(fù)雜的核桃種質(zhì)資源體系[3-4]。

核桃具有一定的無(wú)融合生殖能力，在不經(jīng)過(guò)精卵受精結(jié)合的情況下就能繁殖后代，也叫孤雌生殖[5-6]。核桃的無(wú)融合生殖，能有效利用其雜種優(yōu)勢(shì)，使子代的遺傳特性得以純化，保持母本的優(yōu)良性狀，對(duì)現(xiàn)有品種復(fù)壯、選育矮化砧、減少配置授粉樹(shù)等具有很大作用，且能協(xié)助有性生殖，提高坐果率，增加產(chǎn)量[7-8]。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)核桃的無(wú)融合生殖都做過(guò)研究，Bekir等[9]用9年的時(shí)間觀察表明中歐38個(gè)核桃品種中18.5%的品種具有孤雌生殖能力；1963年，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)對(duì)核桃進(jìn)行去雄套帶隔離的方法，觀察到坐果率為1.2%，1983年，在河北省涉縣觀察到核桃孤雌生殖率為4.08%～43.7%[10-11]；杜蕊等[12]、寧萬(wàn)軍等[13]、李迎超[14]、高紹棠等[15]采用去雄套袋、聚乙烯醇封柱頭、藥劑處理柱頭、切除柱頭等方法，都表明核桃具有無(wú)融合生殖能力，且采用不同的處理方法其無(wú)融合生殖坐果率也不同。目前，對(duì)云南核桃無(wú)融合生殖的研究甚少。本研究通過(guò)對(duì)云南核桃實(shí)施不同的無(wú)融合生殖處理，測(cè)定其無(wú)融合生殖率和果實(shí)生長(zhǎng)量，為云南核桃優(yōu)良品種遺傳特性純化提供基礎(chǔ)，同時(shí)為提高坐果率、增加產(chǎn)量、選育矮化砧等生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

漾濞泡核桃和娘青核桃為云南傳統(tǒng)栽培深紋核桃品種，采自云南省大理州漾濞縣平坡鎮(zhèn)高發(fā)村（北緯 25°32′，東經(jīng) 99°57′），海拔 2 010 m，年平均氣溫14.2 ℃，年降水量935.1 mm，土壤類型黃棕壤。云新301和云新303，為深紋核桃與普通核桃雜交種，采自云南省林業(yè)科學(xué)院昆明樹(shù)木園（北緯 25°08′，東經(jīng) 102°45′），海拔 1 970 m，年平均氣溫14.7 ℃，年降水量1 100 mm，土壤類型紅壤[16]。樹(shù)體生長(zhǎng)健壯，15年生，常規(guī)管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)處理

于2018年2月，雌花柱頭顯露時(shí)，去掉雄花序，采取套硫酸紙袋的方法，以自然授粉為CK，每個(gè)品種套150個(gè)紙袋，每個(gè)紙袋套2～5個(gè)雌花。掛牌標(biāo)記。雌花柱頭顯露時(shí)，切除柱頭，每個(gè)品種切除150個(gè)結(jié)果枝的雌花柱頭，每個(gè)結(jié)果枝2～5個(gè)雌花，掛牌標(biāo)記。

1.2.2 坐果數(shù)、無(wú)融合生殖率計(jì)算方法

統(tǒng)計(jì)各品種的去雄套袋組、切柱頭組、CK的原始雌花數(shù)。去雄套袋組雌花柱頭萎蔫后去除紙袋。在第1次生理落果后統(tǒng)計(jì)各品種各個(gè)組的雌花坐果數(shù)；果實(shí)成熟時(shí)統(tǒng)計(jì)各品種各個(gè)組的果實(shí)數(shù)量。按公式（1）～（2）計(jì)算坐果率和無(wú)融合生殖率。

1.2.3 花粉管生長(zhǎng)情況觀測(cè)方法

從試驗(yàn)處理開(kāi)始，每個(gè)處理組每天采樣1次，每次采樣3～4個(gè)雌花，直至雄花凋落完畢、雌花柱頭萎蔫。3個(gè)處理組都將整個(gè)雌花作為觀測(cè)材料，其中CK和去雄套袋組帶柱頭一起觀測(cè)，切柱頭組觀測(cè)子房部分。將所選材料經(jīng)過(guò)FPA70固定液固定，置于沖洗瓶中沖洗8 h，加入8 mol/L NaOH浸泡15 h，苯胺藍(lán)染色10 h，在載玻片上壓制材料后放在ZLDF-KY2倒置熒光顯微鏡（上海奮業(yè)光電儀器設(shè)備有限公司，中國(guó)）下觀察子房?jī)?nèi)是否有花粉管生長(zhǎng)或柱頭上是否有花粉萌發(fā)[17]。

1.2.4 無(wú)融合生殖果實(shí)生長(zhǎng)量測(cè)定方法

在幼果生長(zhǎng)期，每6 d采樣1次；在坐果穩(wěn)定后，每15～20 d采樣1次。每個(gè)品種的每個(gè)處理每次采6～8個(gè)幼果，測(cè)其縱徑、橫徑、棱徑和質(zhì)量，觀察果實(shí)生長(zhǎng)情況。在果實(shí)生長(zhǎng)過(guò)程中，對(duì)坐果時(shí)期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，觀測(cè)物候期。有20%的雄花序基部小花開(kāi)始分裂時(shí)為雄花始期；有20%的雌花顯現(xiàn)時(shí)為雌花始期；雌花柱頭剛綻放時(shí)為雌花柱頭顯露期，此時(shí)進(jìn)行無(wú)融合生殖處理（去雄套袋、切柱頭）；幼果在非病蟲(chóng)害等外界破壞下大量脫落時(shí)為生理落果期；果實(shí)生長(zhǎng)穩(wěn)定時(shí)為穩(wěn)果期。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)，Origin軟件作圖，SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 云南核桃無(wú)融合生殖果實(shí)坐果時(shí)期

由表1可知，4個(gè)核桃品種均為雄先型植株。云新301的花期最早，3月3日就有雄花出現(xiàn)，3月5日雌花也逐漸出現(xiàn)；其次是云新303，較云新301晚1周左右；漾濞泡核桃3月16日雄花出現(xiàn)，3月25日雌花出現(xiàn)；娘青核桃的物候期最晚，到3月底才有雌、雄花出現(xiàn)，較漾濞泡核桃晚6～7 d。4個(gè)品種的無(wú)融合生殖處理時(shí)間規(guī)律基本相同，在雌花出現(xiàn)1周左右（雌花柱頭剛剛顯露時(shí)）進(jìn)行去雄套袋和切柱頭的無(wú)融合生殖處理，套袋組在套袋后20 d左右去袋（此時(shí)柱頭萎蔫）；去雄套袋和切柱頭處理后25～30 d出現(xiàn)生理大落果，再經(jīng)過(guò)4～6 d進(jìn)入穩(wěn)果期，其中套袋組比切柱頭組要晚1～2 d，CK較無(wú)融合生殖處理組早2～4 d。

表 1 云南核桃2018年無(wú)融合生殖物候期Table 1 Apomixis phenology of J. regia in 2018

可見(jiàn)，云南核桃無(wú)融合生殖處理后，其果實(shí)發(fā)育各個(gè)時(shí)期均晚于CK。在去雄套袋和切除柱頭處理后，切除柱頭處理的物候期稍早于去雄套袋處理1～2 d，說(shuō)明切除柱頭處理的坐果期更早，有利于無(wú)融合生殖果實(shí)的發(fā)育。

2.2 云南核桃無(wú)融合生殖率測(cè)定

由表2可知，在4個(gè)供試品種中，漾濞泡核桃、娘青核桃的自然坐果率為58.85%、57.67%，雜交品種云新301、云新303的自然坐果率為64.67%、72.89%；漾濞泡核桃、娘青核桃、云新301和云新303的無(wú)融合生殖率分別為2.77%～37.11%、4.63%～44.89%、6.8%～10.04%和3.79%～7.28%。從整體看，傳統(tǒng)栽培品種漾濞泡核桃、娘青核桃的無(wú)融合生殖率高于雜交品種云新301、云新303?？梢?jiàn)，雜交核桃品種云新301、云新303的自然坐果率高于傳統(tǒng)栽培品種漾濞泡核桃、娘青核桃，無(wú)融合生殖率卻低于傳統(tǒng)栽培品種漾濞泡核桃、娘青核桃，其中，娘青核桃的無(wú)融合生殖率最高，云新303的無(wú)融合生殖率最低。

從4個(gè)供試品種來(lái)看，切柱頭的無(wú)融合生殖處理組的無(wú)融合生殖率高于去雄套袋組。漾濞泡核桃切柱頭組的無(wú)融合生殖率為37.11%，而去雄套袋組僅為2.77%；娘青核桃切柱頭組的無(wú)融合生殖率為44.89%，去雄套袋組僅為4.63%；云新303切柱頭組的無(wú)融合生殖率為7.28%，去雄套袋組為3.79%；云新301去雄套袋組的無(wú)融合生殖率為6.8%，是4個(gè)供試品種中最高的，但其切柱頭組的無(wú)融合生殖率為10.04%，還是高于去雄套袋組。4個(gè)供試品種中，無(wú)融合生殖坐果率與自然授粉坐果率差異顯著（P＜0.05），無(wú)融合生殖處理中去雄套袋處理的無(wú)融合生殖率與切柱頭處理的無(wú)融合生殖率差異顯著（P＜0.05）。

綜合上述分析表明，云南核桃的無(wú)融合生殖率為2.77%～44.89%，其中云南傳統(tǒng)栽培品種的無(wú)融合生殖率高于雜交品種的無(wú)融合生殖率，分別為2.77%～44.89%和3.79%～10.04%。針對(duì)云南核桃不同的無(wú)融合生殖處理其無(wú)融合生殖率有顯著差異（P＜0.05），切除柱頭的無(wú)融合生殖率可達(dá)7.28%～44.89%，而去雄套袋的無(wú)融合生殖率僅為2.77%～6.8%，切柱頭處理的無(wú)融合生殖率高于去雄套袋處理。

表 2 云南核桃無(wú)融合生殖率差異分析Table 2 Difference analysis of apomictic rate of J. regia

2.3 授粉情況及花粉管檢測(cè)結(jié)果

為了驗(yàn)證無(wú)融合生殖的準(zhǔn)確性，對(duì)所試品種不同無(wú)融合生殖處理的授粉情況及花粉管生長(zhǎng)情況進(jìn)行了檢測(cè)。如圖1所示，圖1a為CK的熒光觀測(cè)情況，在圖中箭頭所指為花粉管和花粉粒，可明顯觀測(cè)到柱頭上的花粉粒和花粉管生長(zhǎng)；圖1b和圖1c為無(wú)融合生殖處理組的熒光觀測(cè)情況，其中圖1b為去雄套袋組，圖1c為切柱頭組，在圖中均未觀察到花粉粒和花粉管。

圖 1 不同處理子房或柱頭內(nèi)花粉粒和花粉管分布情況Fig. 1 Distribution of pollen grains and pollen tubes in different treatment ovaries or stigma

CK的雌花在經(jīng)過(guò)授粉受精后，花粉粒在柱頭頂端萌發(fā)，從而在柱頭和子房?jī)?nèi)有花粉管生長(zhǎng)；無(wú)融合生殖處理的雌花通過(guò)去雄套袋、切柱頭后，不經(jīng)過(guò)授粉受精，因此柱頭和子房?jī)?nèi)無(wú)花粉管分布。

2.4 云南核桃無(wú)融合生殖果實(shí)生長(zhǎng)量測(cè)定結(jié)果

2.4.1 云南核桃無(wú)融合生殖果實(shí)大小

由圖2可知，在去雄套袋、切除柱頭和自然授粉3個(gè)處理中，果實(shí)大小的生長(zhǎng)有一定的差異，其中自然授粉的果實(shí)生長(zhǎng)最快，切除柱頭處理與自然授粉接近，而去雄套袋的果實(shí)生長(zhǎng)最慢。從圖中折線走勢(shì)看，到穩(wěn)果后果實(shí)大小生長(zhǎng)開(kāi)始加速，直到硬果期，各個(gè)處理的果實(shí)大小逐漸接近，趨于穩(wěn)定。

2.4.2 云南核桃無(wú)融合生殖果實(shí)質(zhì)量

由圖3可知，在去雄套袋、切除柱頭和自然授粉3個(gè)處理中，果實(shí)質(zhì)量的增長(zhǎng)有一定的差異，其中自然授粉的果實(shí)重量增長(zhǎng)最快，切除柱頭處理次之，去雄套袋處理的果實(shí)增長(zhǎng)最慢。從圖中折線走勢(shì)看，在坐果穩(wěn)定后，果實(shí)質(zhì)量增長(zhǎng)加快，呈加速上升趨勢(shì)，說(shuō)明此階段為核桃內(nèi)含物增長(zhǎng)的關(guān)鍵時(shí)期。

圖 2 云南核桃2018年無(wú)融合生殖果實(shí)大小生長(zhǎng)情況Fig. 2 Apomictic fruit size growth of J. regia， 2018

圖 3 云南核桃無(wú)融合生殖果實(shí)質(zhì)量增長(zhǎng)情況Fig. 3 Apomictic fruit weight growth of J. regia

綜合圖2、圖3可知，不同處理的云南核桃無(wú)融合生殖果實(shí)生長(zhǎng)量有很大差異。其中，切除柱頭處理的無(wú)融合生殖果實(shí)生長(zhǎng)較快，與自然授粉組基本一致，而去雄套袋處理果實(shí)生長(zhǎng)相對(duì)緩慢。說(shuō)明無(wú)融合生殖處理對(duì)果實(shí)生長(zhǎng)有一定的影響，尤其是去雄套袋處理，果實(shí)生長(zhǎng)遲緩。因此，選擇合適的無(wú)融合生殖處理方法對(duì)果實(shí)正常生長(zhǎng)很重要。

3 結(jié)論與討論

云南核桃的無(wú)融合生殖率為2.77%～44.89%，其中云南傳統(tǒng)栽培品種的無(wú)融合生殖率高于雜交品種的無(wú)融合生殖率，分別為2.77%～44.89%和3.79%～10.04%。不同的無(wú)融合生殖處理其無(wú)融合生殖率有顯著差異，切除柱頭的無(wú)融合生殖率可達(dá)7.28%～44.89%，而去雄套袋的無(wú)融合生殖率僅為2.77%～6.8%。無(wú)融合生殖的果實(shí)發(fā)育晚于自然授粉，無(wú)融合生殖處理方式不同，其果實(shí)生長(zhǎng)規(guī)律也有所差異。

云南核桃無(wú)融合生殖率受無(wú)融合生殖處理方式的影響，切柱頭處理的無(wú)融合生殖率高于去雄套袋處理，這與寧萬(wàn)軍等[13]的研究結(jié)果一致。去雄套袋處理在套袋期間阻隔了雌花與外界的接觸，減少了陽(yáng)光、空氣等對(duì)雌花發(fā)育、枝梢生長(zhǎng)的作用，在一定程度上對(duì)樹(shù)體的正常生長(zhǎng)發(fā)育有影響；而切柱頭處理除了隔絕雌花柱頭授粉受精外，對(duì)外界環(huán)境與樹(shù)體之間的相互作用毫無(wú)影響，相對(duì)是一種理想的無(wú)融合生殖處理方式。

本研究根據(jù)核桃品種特性，針對(duì)不同的品種選擇最佳的適宜區(qū)域進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中娘青核桃為云南傳統(tǒng)栽培品種中的一種農(nóng)家品種，適宜于高海拔地區(qū)，在漾濞縣海拔2 000 m左右的山區(qū)表現(xiàn)良好[18]；而云新301和云新303是云南省培育的早實(shí)新品種，是云南大姚三臺(tái)核桃為母本、新疆核桃新早13號(hào)為父本的種間雜交品種，在滇中一帶表現(xiàn)良好[19-20]。張強(qiáng)等[21]通過(guò)對(duì)新疆2個(gè)主栽核桃品種的無(wú)融合生殖研究，表明其無(wú)融合生殖率為17.8%～58.8%，王國(guó)安等[10]對(duì)新疆核桃進(jìn)行研究后報(bào)道，無(wú)融合生殖率達(dá)8.17%～69.44%，而本研究云新系列核桃的無(wú)融合生殖率僅為3.79%～10.04%，出現(xiàn)這一差異的原因是否為雜交后生殖生理特性發(fā)生變化，或是環(huán)境因素造成，還有待進(jìn)一步研究。

無(wú)融合生殖處理方法很多，最常用的為去雄套袋隔離，也可以采取切除柱頭、藥劑處理、花粉蒙導(dǎo)等方法，目的就是隔絕授粉受精，產(chǎn)生無(wú)融合生殖純合體。對(duì)于無(wú)融合生殖率的計(jì)算，許多學(xué)者有不同的方法，王國(guó)安等[10]、張強(qiáng)等[21]用去雄套袋后的結(jié)果數(shù)與套袋雌花總數(shù)的比值作為無(wú)融合生殖率；張鵬飛[5]、張美勇等[22]先用去雄套袋后的結(jié)果數(shù)比上套袋雌花數(shù)，再用這個(gè)比值比上自然授粉坐果率，最終所得的比值作為無(wú)融合生殖率。核桃具有一定的無(wú)融合生殖能力，在自然授粉的果實(shí)中也包含了部分無(wú)融合生殖胚形成的果實(shí)，所以在計(jì)算無(wú)融合生殖率時(shí)應(yīng)理解為無(wú)融合生殖胚所形成的果實(shí)占自然授粉條件下形成的全部果實(shí)的百分率。因此，前者應(yīng)為核桃無(wú)融合生殖坐果率，后者為無(wú)融合生殖率。

云南核桃無(wú)融合生殖處理后，其果實(shí)發(fā)育晚于自然授粉，不同處理的無(wú)融合生殖果實(shí)生長(zhǎng)量有很大差異。說(shuō)明無(wú)融合生殖處理對(duì)果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育有一定的影響，切除柱頭處理后的果實(shí)生長(zhǎng)與自然授粉基本一致，去雄套袋處理的果實(shí)生長(zhǎng)有所遲緩。選擇合適的無(wú)融合生殖處理方法對(duì)提高無(wú)融合生殖率、促進(jìn)果實(shí)正常生長(zhǎng)發(fā)育具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。