擬南芥AtIDD4與3×Flag融合蛋白表達植株的構建及其鑒定

吳 嘉 楊紅玉 喬菊香， 張國斌 陳俊丞 黃 瓊 王云月

( 1. 云南農業大學植物保護學院，云南 昆明 650201；2. 昆明學院生命科學與技術系，云南 昆明 650214；3. 昆明醫科大學基礎醫學院，云南 昆明 650500)

轉錄因子（TF）是一類以特定強度在特定時間空間與靶基因結合，從而控制靶基因表達的蛋白質，TF在基因表達調控中一直都是分子生物學領域研究的熱點之一。研究轉錄因子的方法很多，但目前只有染色質免疫共沉淀技術（ChIP）是唯一在體內研究兩者互作的技術。ChIP技術是在活細胞狀態下固定蛋白質-DNA復合物，將其隨機切斷為200～1 000 bp長度的染色質片段。通過免疫學方法制備特異性抗體，利用抗原抗體結合的特性富集與目的蛋白結合的DNA。在ChIP中較為關鍵的一個步驟就是抗原抗體的結合，然而傳統獲得抗體的方法是將抗原注入兔子或者老鼠體內，從血清中分離相應的抗體，這一方法的缺點在于抗體制備和純化時間長，很可能每次獲得的抗體都不一樣，尤其像轉錄因子這一類在植物體內含量極低的蛋白獲得專一抗體的難度就更大。

為了解決ChIP實驗中轉錄因子蛋白含量低和特異性抗體難獲得這2個難點，本實驗首先通過轉基因過量表達技術來提高轉錄因子AtIDD4的表達量，其次利用蛋白質+標簽融合表達技術解決抗原抗體特異性低的問題。目前使用較為廣泛的標簽有 Myc、HA、Flag、His、GST、3×Flag 等，其中Flag標簽于1988年被Hopp等[1]首次報道，之后這一標簽被廣泛用于各種生物[2-6]。但隨著使用范圍的擴大，單個Flag標簽的一些不足之處也顯現出來[7]。由于Flag標簽存在一些缺陷，后來開發出了3×Flag標簽，這一標簽的表面是親水的，大小為2.73 kDa，可以檢測到10 fmol的表達融合蛋白。Yoshigi等[8]在研究果蠅PINCH蛋白功能時利用3×Flag標簽鑒定出與果蠅PINCH特異性相互作用的5種新的蛋白質伴侶。2013年Jiang等[9]在研究細菌III型分泌效應物（T3SEs）的分子基礎時利用 3×Flag標簽構建出 3×Flag-HopZ1a，從而證明了細菌效應子直接操縱植物激素信號傳導的核心調節物。目前3×Flag標簽已廣泛在動物、人和微生物細胞內運用，但在植物細胞中的運用還少見報道。

擬南芥中AT2G02080基因編碼一個C2H2型鋅指蛋白，預測為轉錄因子[10]被稱為AtIDD4。DELLA蛋白是赤霉素（GA）信號傳遞過程中關鍵的負調控因子，由于DELLA蛋白缺乏DNA結合域，因此介導DELLA/DNA相互作用的中間蛋白被認為是激活DELLA靶基因所必需的。Yoshida等人的研究結果表明，DELLA和SCL3利用擬南芥 AtIDDs（AtIDD3、AtIDD4、AtIDD5、AtIDD9和AtIDD10）作為DNA結合的轉錄支架，拮抗其下游靶基因的表達，從而控制GA信號通路[11]。但AtIDD4結合的下游靶基因并未見有報道，因此為了研究AtIDD4與哪些基因結合，如何調控下游靶基因的表達，本實驗構建出35SAtIDD4CDS-3×Flag原核表達載體，通過轉基因技術將其導入擬南芥野生型植株中，從而獲得大量高質量的重組蛋白，為后續的ChIP實驗提供了材料基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana）為Columbia生態型（Col）由昆明學院提供，農桿菌GV3101購自上海唯地生物技術有限公司，實驗中所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 載體構建

1.2.1 擬南芥總RNA和DNA的提取

植物總RNA用Trizol法提取[12]。材料液氮充分研磨并迅速轉至離心管中，加1 mL Trizol劇烈晃動，室溫放置5 min，加入200 μL氯仿，劇烈晃動，室溫放置3 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min；取上清至另一離心管中，加入500 μL異丙醇混勻，室溫放置10 min；4 ℃，12 000 r/min離心10 min；棄上清，加入1 mL 75%乙醇洗沉淀；4 ℃，8 000 r/min離心5 min，棄上清；室溫干燥；加入50 μL DEPC水溶解RNA；取2 μL樣品用分光光度計（NanoDrop 2 000Thermo Scientific，USA）進行RNA濃度和純度測定并用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，其余的RNA用液氮速凍-80 ℃保存備用。

植物DNA用CTAB法提取[13]，材料液氮充分研磨并迅速轉至離心管中，加入750 μL CTAB提取液，65 ℃溫浴 30 min；加入 750 μL酚氯仿，4 ℃，12 000 r/min離心10 min；吸取上清至另一離心管，加入2/3倍體積的異丙醇-20 ℃放置過夜；4 ℃，12 000 r/min離心15 min；棄上清，加70%乙醇洗滌2次；室溫晾干；加入50 μL滅菌水溶解 DNA；取 2 μL樣品進行 DNA濃度和純度的測定，其余液氮速凍-80 ℃保存備用。

1.2.2 反轉錄合成cDNA

RNA樣品經DNaseⅠ處理用于消化DNA，加入1 μL Stop Solution混勻后瞬時離心，70 ℃處理10 min終止反應。加入1 μL oligo-dT，1 μL 10 mmol/L dNTP，65 ℃處理5 min，迅速置于冰上5 min，短暫離心，加入5×First-Strand solution 4 μL、0.1 mol/L DTT 2 μL 和 RNase inhibitor 1 μL，37 ℃ 2 min；最后加入 1 μL M-MLV反轉錄酶，37 ℃，45 min，之后70 ℃處理15 min終止反應。

1.2.3 克隆目的基因

PCR（Polymerase Chain Reaction）擴增目的基因，PCR 配方：Pfu DNA Polymerase 0.5 μL；10×Pfu Buffer 5 μL；dNTP（2.5 mmol/L）5 μL；5′ 引物 （ 10 μmol/L） 2 μL； 3′ 引 物 （ 10 μmol/L）2 μL；模板 DNA 3 μL；ddH2O 補足至 50 μL。

引 物 ： IDD4-F： 5 ′-GAAGATCTATGTCGTCATCATCATATAAC-3′;

IDD4-R：5′-CGAGCTCTCAACCTCTTCCAAATGGATA-3′。

PCR反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性 45 s，56 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 2 min，共35個循環；72 ℃延伸7 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收DNA片段。

1.2.4 DNA片段與T載體連接

DNA回收片段與改造過的pCAMLA1300載體連接，4 ℃過夜，構建的載體pCAMBLA1300-IDD4CDS-3×Flag 如圖 1。

圖 1 pCAMBLA1300-IDD4CDS-3×Flag載體示意Fig. 1 pCAMBLA1300-IDD4CDS-3×Flag vector map

1.3 農桿菌轉化

從-80 ℃冰箱取出感受態GV3101，冰上解凍加入3～5 μL重組質粒，冰上放置5 min。將離心管置于液氮中速凍1 min，37 ℃水浴5 min，冰浴2 min，加入800 μL液體LB培養基，28 ℃搖床150 r/min培養3 h。8 000 r/min離心1 min，棄上清，懸浮涂于含Kan和利福平固體LB培養基上28 ℃培養48 h。挑取單克隆PCR鑒定。成功轉化的農桿菌保種備用。

1.4 擬南芥的種植及轉化

1.4.1 擬南芥種植及去頂

種子播撒在MS培養基上，7～10 d后轉移到土壤中，保鮮膜覆蓋48 h，揭膜后在光照強度為2 000～3 000 lx，光照時間12 h/d，濕度40%～60%的環境中栽培[14]。移栽后25～30 d后，在擬南芥初次開花時將花蕾剪掉，以促進側枝長出更多的花枝。轉化時選擇沒有成熟的花序。

1.4.2 擬南芥轉化

在5%的蔗糖溶液中重懸農桿菌使OD為0.8，加入表面活性劑silwet-77至濃度0.05%。將擬南芥的花表面浸泡在農桿菌懸浮液中20～30 s，浸染后植株套袋保持高度的濕潤狀態暗室培養24 h，之后正常培養。待種子成熟角果自然開裂后收集種子。

1.5 轉基因種子篩選

在含有潮霉素抗生素的平板上培養浸染后收集的種子，成功轉入重組質粒的種子能夠在抗性培養基上正常生長。非轉基因種子不能正常生長，主要表現為未成功轉基因的種子僅能長出2片子葉，同時根生長也受到嚴重抑制，一般萌發10 d后死亡。成功轉基因的種子能正常生長，之后將成功轉基因的陽性植株轉入土壤繼續培養直至開花單株收種。

1.6 轉基因陽性植株的鑒定

轉基因陽性植株PCR鑒定：CTAB法[13]提取陽性植株葉片基因組DNA，設計引物進行PCR驗證。

PCR 配方：10×ExTaq Buffer 2 μL；dNTPs（each of 2 mmol/L）1 μL；5′引物（10 μmol/L）0.4 μL；3′引物（10 μmol/L）0.4 μL；模板 DNA 1 μL；Ex-Taq 0.5 μL；ddH2O 14.7 μL。

引物為 IDD4YZ-F：5′-CAATTTGGAGACAATGG-3′；

IDD4YZ-R：5′-AGAGGCCACGATTTGACACA-3′。

PCR反應程序：98 ℃預變性5 min；98 ℃變性 10 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共35個循環；72 ℃延伸5 min。

1.7 實時熒光定量RT-PCR測定

利用實時熒光定量RT-PCR測定轉基因突變體植株和野生型植株AtIDD4基因表達量的差異。分別以野生型和突變體植株的cDNA為模板，擴增內參Actin基因和AtIDD4基因。實時熒光定量RT-PCR反應按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒操作步驟要求進行，在LightCycler? 480 II型熒光定量PCR儀（Roche，Swiss）上進行反應。

反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環。

內參Actin基因引物：actin-F：5′-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3′；

actin-R：5′-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3′。

每個樣品作3次重復。

2 結果與分析

2.1 重組質粒鑒定結果

獲得重組質粒35S-AtIDD4CDS-3×Flag后進行PCR驗證，目的是驗證重組質粒是否包含了正確的AtIDD4基因的CDS（Coding sequence）序列和正確的3×Flag序列。經PCR擴增、電泳和切膠測序。測序結果見圖2。

圖 2 測序結果Fig. 2 The result of sequencing

測序結果與TAIR（https://www.arabidopsis.org/）網上公布的序列進行對比，比對結果顯示下劃線部分確為AtIDD4基因序列，而加框部分為3×Flag標簽序列，說明成功獲得了重組質粒。

2.2 轉基因植株的篩選種植

重組質粒測序正確后導入農桿菌中，然后用花序浸染法將其導入擬南芥植物中，收獲轉基因T0代種子。待T0種子完全干燥且度過休眠期后，播種于含有抗生素的MS培養基上，如圖3a-b。非轉基因種子不能正常生長，一般萌發10 d后死亡。之后將陽性植株轉入土壤繼續培養直至開花單株收種，見圖3c-d。

圖 3 AT2G02080-3×Flag擬南芥轉基因植株Fig. 3 AT2G02080-3×Flag mutant plants

2.3 轉基因植株的鑒定

播種T1代種子，獲得轉基因植株后對轉基因植株進行PCR驗證，擴增預計的產物約為750 bp。結果得到了預期的PCR產物（圖4），空白對照和野生型陰性對照無條帶，而質粒陽性對照、AT2G02080-3×Flag-2、AT2G02080-3×Flag-3和AT2-G02080-3×Flag-4轉基因株系有清晰的條帶，說明成功獲得了轉基因突變體植株。

2.4 轉基因植株AtIDD4表達量檢測

用轉基因的T3代植株為材料，通過實時熒光定量RT-PCR檢測AtIDD4基因表達量，以野生型植株為對照，擬南芥Actin為內參基因。結果表明，轉基因株系中AtIDD4的表達量明顯高于野生型植株檢測結果見圖5和圖6，說明實驗獲得了攜帶3×Flag標簽的AtIDD4超表達轉基因植株。

圖 4 PCR檢測AT2G02080-3×Flag轉基因陽性植株Fig. 4 Detection of AT2G02080-3×Flag transgenic positive plants by PCR

圖 5 半定量PCR結果Fig. 5 The results by semi-quantitative PCR

圖 6 野生型植株和AT2G02080-3×Flag-3轉基因植株AtIDD4基因表達量Fig. 6 Expression of AtIDD4 in wild type and AT2G02080-3×Flag-3 mutant plants

3 結論與討論

重組蛋白技術和ChIP技術自報道以來就受到各國研究者廣泛使用。雖然很多實驗都利用Flag標簽獲得重組蛋白，并通過ChIP技術得了預期的結果，但Flag的不足之處也是顯而易見的。因為它只有8個氨基酸殘基，所以它的單克隆抗體純化基質不穩定[7]。基于以上這些原因本實驗選擇3×Flag標簽來避免單個Flag標簽的不足之處。

有研究者認為DELLA蛋白是GA信號傳遞過程中的負調控因子，以前一直認為SCL3是DELLA的直接靶基因。但由于DELLA缺乏DNA結合域，因此DELLA與SCL3中間一定存在某種蛋白來介導。2014年Yoshida等[11]的研究發現AtIDD家族中的AtIDD3、AtIDD4、AtIDD5、AtIDD9和AtIDD10就是中間蛋白，DELLA/AtIDDs復合物可以上調SCL3的表達量，與此同時SCL3蛋白也與AtIDDs蛋白相互作用，抑制其自身的表達。但實驗未提及AtIDD4的下游靶基因及其調控情況。因此為了尋找AtIDD4的靶基因，研究該轉錄因子在擬南芥中的功能本實驗利用重組蛋白技術和標簽技術來獲得了35S-AtIDD4CDS-3×Flag的擬南芥轉基因植株。實時熒光定量RT-PCR證實了轉基因植株中AtIDD4基因的表達量高于野生型植株。為之后利用商品化的3×Flag抗體來進行ChIP實驗尋找AtIDD4轉錄因子結合的下游靶基因提供了實驗材料，同時也為拓展了3×Flag標簽的運用范圍。