吡格列酮對A549肺癌細胞及RAW264.7巨噬細胞18F-FDG攝取影響的實驗研究

秦露平 呂杰 李建芳 謝良駿 蔣永濼 程木華

【摘要】目的 探討吡格列酮對A549肺癌細胞及RAW264.7巨噬細胞氟代脫氧葡萄糖（18F-FDG）攝取的影響。方法 用不同濃度（0、10、20、50、100、200 μg/ml）的吡格列酮溶液分別作用于A549肺癌細胞及RAW264.7巨噬細胞1 h，加入18F-FDG孵育0.5 h后，用γ計數儀分別檢測細胞18F-FDG攝取變化情況。用100 μg/ml的吡格列酮作用細胞1 h，加入18F-FDG分別孵育0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，并以0 μg/ml吡格列酮溶液作用細胞作為對照組，用γ計數儀分別檢測以上6個時間點細胞18F-FDG攝取變化情況，獲得每分鐘放射性計數（CMP）百分比。結果 吡格列酮濃度為10、20、50、100、200 μg/ml組A549肺癌細胞CMP百分比均高于0 μg/ml組（P均< 0.05）。吡格列酮濃度為10、20、50 μg/ml組巨噬細胞CMP百分比與0 μg/ml組比較差異均無統計學意義（P均> 0.05），吡格列酮濃度為100、200 μg/ml組RAW264.7巨噬細胞的CMP百分比均低于0 μg/ml組（P均< 0.05）。在6個不同時間點，經吡格列酮作用后，肺癌細胞CMP百分比均高于對照組（P均< 0.001），而巨噬細胞CMP百分比均低于對照組（P均< 0.05）。結論 較大劑量吡格列酮短期內能使A549肺癌細胞18F-FDG攝取增高，而使RAW264.7巨噬細胞的18F-FDG攝取減低。

【關鍵詞】吡格列酮;肺癌細胞;巨噬細胞;氟代脫氧葡萄糖

【Abstract】Objective To evaluate the effect of pioglitazone on the 18F-fluorodeoxyglucose （18F-FDG） uptake in the A549 lung cancer cells and RAW264.7 macrophages.? Methods The A549 lung cancer cells and RAW264.7 macrophages were treated with different concentrations of pioglitazone solutions （0， 10， 20， 50， 100 and 200 μg/ml） for 1 h. After incubation with 18F-FDG for 0.5 h， the uptake of 18F-FDG was detected by a γ counter. The cells were treated with 100 μg/ml pioglitazone for 1 h and incubated with 18F-FDG for 0.5， 1.0， 1.5， 2.0， 2.5 and 3.0 h， respectively. The cells untreated with pioglitazone were assigned into the control group. The changes of the 18F-FDG uptake at 6 time points were detected by a γ counter. The percentage of radioactive count per minute （CMP） was calculated.? Results The percentage of CMP in the A549 lung cancer cells treated with 10， 20， 50， 100 and 200 μg/ml of pioglitazone was significantly higher than that in the cells without pioglitazone treatment （all P< 0.05）. The percentage of CMP did not significantly differ between the RAW264.7 macrophages treated with 10， 20 and 50 μg/ml of pioglitazone and those untreated with pioglitazone （all P> 0.05）. The percentage of CMP in the RAW264.7 macrophages treated with 100 and 200 μg/ml of pioglitazone was significantly lower than that in those without pioglitazone treatment （both P< 0.05）. At 6 time points， the percentage of CMP in the lung cancer cells treated with pioglitazone was considerably higher than that in the control group （all P< 0.001）， whereas the percentage of CMP in the macrophages treated with pioglitazone was significantly lower compared with that in the control group （all P< 0.05）.? Conclusion Treatment with a large dose of pioglitazone can increase the short-term 18F-FDG uptake in the A549 lung cancer cells， whereas decrease the 18F-FDG uptake in the RAW264.7 macrophages.

【Key words】Pioglitazone;Lung cancer cell;Macrophage;18F-fluorodeoxyglucose

正電子發射斷層顯像/X線計算機體層成像（PET/CT）自問世之后，在肺癌的診斷、鑒別診斷、臨床分期、療效監測等應用多年。目前臨床應用廣泛的腫瘤示蹤劑是氟代脫氧葡萄糖（18F-FDG），但18F-FDG 在炎性病變也能被明顯攝取，因此其對于肺癌的鑒別診斷存在一定困難。炎性病變的病理生理機制非常復雜，不同病理階段有許多中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞浸潤。這些炎性細胞往往與腫瘤細胞在糖代謝途徑方面存在相類似的多重機制，導致炎性細胞能像腫瘤細胞一樣高度攝取葡萄糖[1]。吡格列酮是臨床較常用的抗2型糖尿病藥物，作為一種過氧化物酶增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）激動劑，能通過激動PPAR-γ增強胰島素敏感性以提高機體對葡萄糖的攝取，同時能抑制炎癥反應[2-5]。本研究以此為出發點，在體外細胞試驗角度，研究吡格列酮對A549肺癌細胞及RAW264.7巨噬細胞葡萄糖代謝的影響，觀察吡格列酮介入后2種細胞的糖代謝是否發生不同反應，從而對兩者進行鑒別。

材料與方法

一、材 料

A549肺癌細胞株來源于上海科學院細胞庫，RAW264.7 小鼠巨噬細胞株來源于中國醫學科學院基礎醫學院研究所基礎醫學細胞中心。DEME高糖培養基、DEME無糖培養基、新生胎牛血清、0.25%胰酶+依地酸二鈉（EDTA）、磷酸鹽緩沖液（PBS）均由廣州杰特韋公司提供，二甲亞砜溶劑由凱基生物公司提供。吡格列酮粉劑（純度≥98%）由佑佰生物公司提供。18F-FDG由廣州原子高科同位素有限公司提供。24孔板由Corning有限公司提供。Galaxy48R CO2培養箱由美國Eppendorf公司提供。γ放射性計數儀（型號GC-1200）由北京華瑞森科技發展有限公司提供。

二、方 法

1. 細胞培養與種板

A549肺癌細胞及RAW264.7巨噬細胞均用含10%胎牛血清的DEME高糖培養基培養，于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養箱中培養，2 ～ 3 d傳代1次。將密度約2×105/ml的細胞懸液接種于24孔板，每孔接種的細胞懸液體積為0.5 ml，每種細胞分為若干組，每組均為6孔。經過約2 d的培養，待細胞長滿80%視野時，可以開始進行相關處理。

2. 不同濃度吡格列酮對細胞18F-FDG攝取的影響試驗

先用0、10、20、50、100、200 μg/ml吡格列酮溶液分別作用于A549肺癌細胞及RAW264.7巨噬細胞30 min，然后加入放射性活度為37 MBq的18F-FDG放入培養箱孵化30 min。迅速吸掉上述培養基，用PBS洗滌2次，向清洗干凈的培養板中加入胰酶消化獲取細胞懸浮液。將細胞懸浮液置于γ計數儀進行放射性計數，記錄校正后的細胞每分鐘放射性計數（CMP）。

3. 不同時間點100 μg/ml吡格列酮對細胞 18F-FDG攝取的影響實驗

將A549肺癌細胞及RAW264.7巨噬細胞加入0 μg/ml吡格列酮溶液（對照組）作用1.0 h，同時加入18F-FDG分別孵育0.5、1.0、1.5、2.0、2.5及3.0 h，分別檢測6個不同時間點2種細胞的CMP。將上述2種細胞加入100 μg/ml吡格列酮溶液（吡格列酮組）作用1.0 h，同時加入18F-FDG孵育0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，分別檢測6個不同時間點2種細胞的 CMP。

三、CMP百分比

本研究中，細胞對18F-FDG的攝取以CMP百分比表示。CMP百分比（%）=細胞CMP/18F-FDG孵育0.5 h時吡格列酮濃度為0 μg/ml組的細胞平均CMP×100%，即CMP百分比（%）=CMP/平均CMP0×100%。

四、統計學處理

應用GraphPad Prism進行統計分析。計量資料采用表示;不同濃度吡格列酮對細胞18F-FDG攝取的影響采用單因素方差分析，多重比較方法采用Dunnett-t檢驗;不同時間點100 μg/ml吡格列酮對細胞18F-FDG攝取的影響實驗采用重復測量資料方差分析，因時間因素與組間因素存在交互作用，因此采用t檢驗分析單獨效應。P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、不同濃度吡格列酮對細胞18F-FDG攝取的影響

不同濃度吡格列酮作用于A549肺癌細胞的CMP百分比比較差異有統計學意義（F=32.76，P < 0.001），其中吡格列酮濃度為10、20、50、100、200 μg/ml組A549肺癌細胞的CMP百分比均高于0 μg/ml組（P均< 0.05）。

不同濃度吡格列酮作用于RAW264.7巨噬細胞的CMP百分比比較差異有統計學意義（F=6.84，P< 0.05），其中吡格列酮10 μg/ml組、20 μg/ml組、50 μg/ml組RAW264.7巨噬細胞的CMP百分比與0 μg/ml組比較差異均無統計學意義（P均> 0.05），吡格列酮濃度為100 μg/ml、200 μg/ml組巨噬細胞的CMP百分比均低于0 μg/ml組（P均< 0.05）。

二、不同時間點100 μg/ml吡格列酮對細胞 18F-FDG攝取的影響

吡格列酮與時間的交互作用對A549肺癌細胞CMP百分比的影響有統計學意義（F=10.73，P < 0.001）;單獨效應顯示：各時間點吡格列酮組A549肺癌細胞的18F-FDG攝取均高于對照組（t為10.92～20.43，P均< 0.001）。吡格列酮與時間的交互作用對RAW264.7巨噬細胞CMP百分比的影響有統計學意義（F=7.46，P < 0.001）;單獨效應顯示：各時間點吡格列酮組RAW264.7巨噬細胞的CMP百分比均高于對照組（t為3.22～10.28，P均< 0.05）。

討論

PET/CT對于肺癌與肺炎性病變的鑒別診斷一直是臨床的一大難題。目前，無論是應用不同類型PET顯像劑，還是PET目測法或半定量分析，又或者是PET延遲顯像的應用，均不能較好地鑒別肺癌與肺炎性病變[6]。吡格列酮不僅具有抗2型糖尿病效應，還具有抗炎效應。其介入后是否能使肺癌及肺炎性病變糖代謝發生不同改變，從而通過PET/CT鑒別兩者？國內外有較多關于吡格列酮在糖尿病及脂質代謝等方面的研究，但關于PET/CT吡格列酮介入鑒別腫瘤與炎性病變方面的研究有限。因此，本研究從細胞學角度，探究肺癌細胞及巨噬細胞經吡格列酮介入后各自糖代謝發生的改變，嘗試通過不同的糖代謝改變鑒別2種細胞。

本研究首先探索了不同濃度的吡格列酮溶液對2種細胞18F-FDG攝取的影響，研究結果與Cheong等[7]研究基本一致，顯示吡格列酮短期內能使肺癌細胞CMP百分比增高，而較大劑量吡格列酮能使巨噬細胞CMP百分比減低，因此較大劑量吡格列酮能使肺癌細胞與巨噬細胞糖代謝產生不同效應。在研究肺癌細胞與巨噬細胞動態18F-FDG攝取中，2種細胞放射性攝取-時間曲線呈先增高后降低的拋物線趨勢，兩者在體外18F-FDG攝取的高峰時間約為1.5～2 h;而文獻顯示人巨噬細胞在3 h內18F-FDG攝取呈線性增高趨勢，這種細胞動態18F-FDG攝取的差異可能與選取不同的細胞株類型相關[8]。本研究中，對照組肺癌細胞與巨噬細胞動態CMP百分比的變化情況相差不大，僅利用細胞動態18F-FDG 攝取的變化可能無法鑒別肺癌細胞與巨噬細胞，這可能是臨床PET/CT多時相或延遲顯像無法鑒別部分肺癌與肺炎性病變的重要原因之一。通過濃度為100 μg/ml吡格列酮的介入后，2種細胞18F-FDG攝取-時間曲線仍呈拋物線趨勢，18F-FDG 攝取高峰時間基本相同，但吡格列酮組的肺癌細胞CMP百分比均高于對照組，吡格列酮組的巨噬細胞CMP百分比卻均低于對照組。有文獻顯示，吡格列酮具有抑制腫瘤細胞生長及促進其凋亡的作用，生長受抑制的腫瘤細胞糖代謝將減低[9-10]。本研究顯示，吡格列酮介入后肺癌細胞18F-FDG攝取增高或糖代謝增高。其主要原因可能與吡格列酮作用時間長短有關，本研究中的吡格列酮作用時間只有1 h，而使腫瘤細胞生長抑制至少需要1 d以上時間。因此，本研究在體外細胞試驗證實吡格列酮短期介入后可使肺癌細胞與巨噬細胞糖代謝發生不同改變，通過這種變化可以將肺癌細胞與巨噬細胞鑒別開來。盡管如此，本研究僅立足于體外細胞試驗，而且肺癌及炎性細胞類型有限，是否其他種類肺癌細胞及炎性細胞經吡格列酮介入后糖代謝會發生不同改變，活體動物試驗結果是否與體外細胞實驗結果一致，以及吡格列酮所致細胞糖代謝改變的分子機制等問題將值得進一步深入研究。

綜上所述，體外細胞試驗顯示較大劑量吡格列酮短期介入后，A549肺癌細胞18F-FDG攝取增高，而RAW264.7巨噬細胞的18F-FDG攝取減低。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2018-10-18）

（本文編輯：林燕薇）