丁酸鈉通過激活cAMP通路在脂肪肝細胞模型中增加線粒體生成及脂肪氧化

柯比倫?譚嗣偉?易家志?劉慧玲?江潔?吳斌

【摘要】目的 探討丁酸鈉對肝臟細胞代謝保護作用機制以及其與線粒體功能的關系。方法 采用1c1c7肝細胞進行實驗，檢測線粒體及脂肪氧化相關轉錄基因、蛋白表達以及三磷酸腺苷（ATP）生成。首先使用棕櫚酸對細胞進行培養檢測線粒體相關基因;其后使用棕櫚酸+丁酸鈉共培養細胞并將其對線粒體和氧化相關基因的效應與棕櫚酸單獨培養相對照;接著單獨以丁酸鈉處理細胞后觀察其對線粒體功能和線粒體相關復合體蛋白的變化趨勢;最后檢測丁酸鈉處理細胞后線粒體功能相關的環磷酸腺苷（cAMP）通路變化趨勢。結果 棕櫚酸可導致線粒體功能相關PGC-1α轉錄受抑;相反，加入丁酸鈉與其共培養處理后細胞線粒體及氧化相關功能基因轉錄增強;使用丁酸鈉培養細胞后線粒體蛋白復合體2轉錄增加，線粒體ATP生成明顯增加;1c1c7細胞使用丁酸鈉培養后，線粒體功能相關的cAMP通路有相應變化，我們發現p-CREB表達增加同時PDE3B受抑制，表明cAMP通路的激活。結論 丁酸鈉可能通過cAMP通路介導其對肝臟脂肪變性中線粒體功能的保護作用。

【關鍵詞】丁酸鈉;脂肪肝;線粒體功能;環磷酸腺苷

Sodium butyrate promotes mitochondria biogenesis and lipid oxidation through activating cAMP pathway in fatty liver cell model Ke Bilun， Tan Siwei， Yi Jiazhi， Liu Huiling， Jiang Jie， Wu Bin. Depart-ment of Gastroenterology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Wu Bin， E-mail： wubin6@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To investigate the mechanism underlying the effect of sodium butyrate on protecting liver metabolism and its relationship with mitochondrial function. ?Methods The 1c1c7 cells were chosen for subsequent experiment. The expression levels of mitochondria and lipid oxidation-related genes and proteins and the production of adenosine triphosphate （ATP） were quantitatively detected. The 1c1c7 cells were cultured by palmitic acid to detect mitochondria-related genes. Subsequently， the cells were co-cultured with palmitic acid combined with sodium butyrate. The effect of palmitic acid combined with sodium butyrate and palmitic acid alone upon the mitochondria and lipid oxidation-related genes was statistically compared. The variation trend of mitochondrial function and mitochondria-related complex protein was observed after the cells were treated with sodium butyrate alone. The changes of the mitochondrial function-related cyclic adenosine monophosphate （cAMP） signaling pathway were detected following sodium butyrate treatment. Results Palmitic acid suppressed the translation of mitochondrial function-related PGC-1α. Conversely， palmitic acid combined with sodium butyrate treatment enhanced the translation of mitochondria and lipid oxidation-related genes. The translation of mitochondrial protein complex 2 and the production of mitochondrial ATP were strengthened after sodium butyrate treatment. The changes of mitochondrial function-related cAMP signaling pathway were observed after the 1c1c7 cells were cultured with sodium butyrate. The expression of p-CREB was up-regulated， whereas that of PDE3B was down-regulated， suggesting that the cAMP signaling pathway was activated. ?Conclusion Sodium butyrate probably mediates the protective effect upon the mitochondrial function via the cAMP signaling pathway in the in fatty liver cell model.

【Key words】Sodium butyrate;Fatty liver;Mitochondrial function;cAMP

近期有研究表明，丁酸鈉對動物模型肥胖具有保護作用，并且其重要作用靶點是線粒體，相關研究表明其在動物實驗中可通過增加脂肪氧化、線粒體呼吸等對線粒體功能起到促進作用。其作用的器官主要為肝臟，能改善高脂飲食模型下的脂肪肝狀態，在骨骼肌及棕色脂肪中也有類似效應[1]。由于長鏈脂肪酸對線粒體功能主要表現為抑制及促凋亡，我們擬比較短鏈脂肪酸與其對線粒體功能的差異，并且用長鏈、短鏈脂肪酸共同培養細胞，以模擬使用短鏈脂肪酸治療食源性脂肪肝的模型。我們的研究表明，丁酸鈉可以減輕由棕櫚酸造成的細胞線粒體相關蛋白和功能的損害，增加能量消耗，并且該作用可能通過環磷酸腺苷（cAMP）通路介導。這為我們日后進一步研究其對脂肪肝的保護機制、保護并促進線粒體功能，并將丁酸鈉使用于臨床對脂肪肝的防治提供了初步依據。

材料與方法

一、材 料

DMEM高糖培養基、胎牛血清（Fetal bovine serum， FBS）、PBS和0.05% EDTA胰酶均購自GiBCO公司。無脂肪酸的胎牛血清（BSA，03117405001）購自羅氏公司，棕櫚酸 （P5585）購自Sigma公司，丁酸鈉（B5887）購自Sigma公司。細胞蛋白提取液CytoBusterTM Protein Extraction Reagent購自美國Novagen公司。溴酚藍、SDS、麗春紅S、吐溫-20℃、1.5 mol/L Tris-cl pH 8.8 和1 mol/L Tris-cl pH 6.8、丙烯酰胺均購自Sigma-Aldrich公司。預染蛋白質分子量Marker購自Fermentas公司。脫脂牛奶購自Cell signaling公司。PVDF膜和化學發光液Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate購自美國Millipore公司。Restore Western BlotStripping Buffer購自Thermo Scientific公司。DTT、 Apotinin、 NP40、PMSF購自德國Boehringer公司。BCA Protein Assay Kit 購自PierceTM。PCR： 定量PCR反應試劑盒SuperScriptTMⅢ Platinum? SYBR? Green One-Step qRT-PCR Kit等購自Invitrogen公司。Tris飽和酚、甘氨酸、氯仿、異丙醇、異戊醇、無水乙醇及NaCl、EDTA、NaOH、NaAc、K2HPO4、KH2PO4和甲醛、甲酰胺、蔗糖、甘油等均購自Sigma公司。

二、方 法

1. 細胞培養

1c1c7細胞（上海中科院ATCC細胞庫）用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養，置于37℃，飽和濕度和5%CO2培養箱中培養，每2 ～ 3 d傳代一次。接種密度約8×105/孔至6孔板中。分別將不同處理加入細胞培養液中按時間點培養及收取。首先使用0.3 mmol/L

胎牛血清作為對照，以及BSA 0.3 mmol/L棕櫚酸作為處理組培養細胞8 h，收取細胞提取RNA并檢測線粒體相關基因PGC-1α。隨后在6孔板培養的1c1c7細胞中加入0.3 mmol/L棕櫚酸作為對照組，以及0.3 mmol/L棕櫚酸+10 mmol/L丁酸鈉作為實驗組，設置1、4、8 h作為培養時間，培養后進行RNA提取，檢測線粒體相關PGC-1α，脂肪氧化相關的CPT1α以及脂肪生成相關基因SREBP。接下來，按不同時間點（0、1、4、8、16 h）使用10 mmol/L丁酸鈉培養細胞及收取細胞提取蛋白進行蛋白免疫印跡試驗，并按不同時間點（0、1、2、4、8、16、24 h）收取細胞使用ATP試劑盒進行檢測。最后，檢測cAMP通路表達情況，設置空白對照、10 mmol/L丁酸鈉組以及10 μmol/L forskolin處理細胞，8 h后收取細胞提取RNA檢測PDE3B轉錄情況;在1c1c7細胞中加入0.3 mmol/L棕櫚酸作為對照，以及0.3 mmol/L棕櫚酸+10 mmol/L丁酸鈉作為實驗組，培養8 h后進行RNA提取并檢測;設置不同時間點（0、1、4、8、16 h）收取細胞提取蛋白檢測p-CREB及PDE3B以及內參蛋白水平。

2. 細胞蛋白的收取及蛋白免疫印跡法試驗

細胞培養過程完畢后，將培養皿放置于冰上，冰PBS液漂洗后用300 ml的裂解液，超聲裂解細胞6下3次。以12 000轉/分的速度，4℃離心15 min，吸取上清即為細胞裂解液，用BCA法進行蛋白定量并平衡濃度。加適量的4×loading buffer，混勻后，用水浴100℃煮沸5 min，以800轉/分的速度離心后，收集上清，于-70℃保存，蛋白待測分析。將樣品上樣至不同濃度的 SDS-PAGE分離膠，用適當的電壓電泳、轉PVDF膜，封閉后用相應一抗溶液在4℃下搖動孵育過夜。次日洗膜后用HRP標記的二抗孵育2 h，洗膜后暗房曝光。

3. RNA提取及PCR

培養細胞及收取細胞后，按RNA提取試劑盒說明提取RNA，測定濃度及純度，根據qPCR逆轉錄試劑盒合成cDNA。應用SYBR Green法對目的基因及內參基因進行Real-time PCR擴增。

4. ATP活性檢測

收取細胞，配制ATP檢測試劑體系：D-Luciferin 10 mmol/L 0.2 ml， Luciferase， firefly recombinant 1 ml， Dithiothreitol （DTT）1 mmol/L 40 ml， 20× Reaction Buffer 0.2 ml， ddH2O 3.56 ml。總體積4 ml。配好后避光保存并于數小時內使用。按濃度梯度配好ATP標準品作為參照。將樣品加入96孔板中，10 ml/孔，加入5個濃度梯度對照的ATP標準品。加入100 ml/孔的檢測液，立即于熒光下讀取數值。

三、統計學處理

應用SPSS 21.0進行統計學分析。正態分布定量資料用表示，2組間比較使用獨立樣本 t檢驗，多組間比較采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、棕櫚酸培養導致1c1c7細胞線粒體相關基因轉錄的變化

使用0.3 mmol/L棕櫚酸造模8 h后收取細胞提取RNA并檢測線粒體相關基因PGC-1α，比較8 h后對照組及實驗組區別。結果顯示1c1c7細胞PGC-1α在棕櫚酸培養后顯著降低（t =3.84，P=0.031），見圖1。

二、棕櫚酸對比棕櫚酸+丁酸鈉共培養對1c1c7細胞線粒體功能的變化

使用1c1c7細胞，加入0.3 mmol/L棕櫚酸作為對照組，以及0.3 mmol/L棕櫚酸+10 mmol/L丁酸鈉作為實驗組，培養后進行蛋白質及RNA提取，檢測線粒體相關PGC-1α，脂肪氧化相關的CPT1α以及脂肪生成相關基因SREBP。結果顯示經丁酸鈉共培養后，細胞線粒體相關PGC-1α（與1 h 棕櫚酸組進行比較，4 h 棕櫚酸組 = 0.97±0.03，LSD-t = 0.18， P = 0.86; 8 h 棕櫚酸組 = 0.49±0.02，LSD-t = 4.03，P = 0.03; 1 h 棕櫚酸+丁酸鈉組 = 2.36±0.12，LSD-t = 15.08，P < 0.01; 4 h 棕櫚酸+丁酸鈉組 = 4.77±0.24， LSD-t = 53.14， P < 0.01; 8 h 棕櫚酸+丁酸鈉組=3.66±0.33，LSD-t = 188.05， P < 0.01; 4 h 棕櫚酸組與4 h 棕櫚酸+丁酸鈉組比較，LSD-t = 79.55，P < 0.01; 8 h 棕櫚酸組與8 h 棕櫚酸+丁酸鈉組比較，LSD-t = 274.21，P < 0.01）及脂肪氧化相關的CPT1α（與1 h 棕櫚酸組進行比較，4 h 棕櫚酸組 = 1.80±0.13，LSD-t = 6.30， P < 0.01; 8 h 棕櫚酸組 = 1.19±0.03， LSD-t = 1.21， P=0.31; 1 h 棕櫚酸+丁酸鈉組 = 1.50±0.09，LSD-t = 3.44， P =0.04; 4 h 棕櫚酸+丁酸鈉組 = 2.23±0.12， LSD-t = 3.38， P= 0.04; 8 h 棕櫚酸+丁酸鈉組 = 1.37±0.02， LSD-t = 2.65， P = 0.07; 4 h 棕櫚酸組與4 h 棕櫚酸+丁酸鈉組比較，LSD-t = 3.39， P = 0.04; 8 h 棕櫚酸組與8 h 棕櫚酸+丁酸鈉組比較，LSD-t = 6.88， P < 0.01）均比單純棕櫚酸培養升高，同時脂肪生成的SREBP（與1 h 棕櫚酸組進行比較，4 h 棕櫚酸組 = 1.21±0.06，LSD-t = 1.65，P = 0.20;8 h 棕櫚酸組 = 1.13±0.02，LSD-t = 1.05，P = 0.37;1 h 棕櫚酸+丁酸鈉組 = 0.98±0.05，LSD-t = 0.13， P = 0.90; 4 h 棕櫚酸+丁酸鈉組 = 0.54±0.03，LSD-t = 5.14， P = 0.01; 8 h 棕櫚酸+丁酸鈉組 = 0.27±0.03，LSD-t = 91.12， P < 0.01; 4 h 棕櫚酸組與4 h 棕櫚酸+丁酸鈉組比較，LSD-t = 47.69，P < 0.01; 8 h 棕櫚酸組與8 h 棕櫚酸+丁酸鈉組比較，LSD-t = 689.60，P < 0.01）均較單獨棕櫚酸培養組下降，見圖2。

三、丁酸鈉對細胞線粒體復合體及ATP生成的影響

按不同時間點使用10 mmol/L丁酸鈉培養細胞及收取細胞，提取線粒體蛋白用于檢測各個復合體相關蛋白，并收取細胞使用ATP試劑盒進行檢測。結果表明，線粒體復合體蛋白complex 2 SDHA及complex 3隨時間推移呈現明顯升高的趨勢，見圖3A。相應的，隨著使用丁酸鈉培養時間的推移，細胞ATP產生隨時間增加而增加，其峰值約為8 ～ 16 h，提示其線粒體活性增加。不同時間點的樣本與初始對照組樣本的差異均有

統計學意義（1 h = 1.16±0.01，LSD-t = 41.45; 2 h

= 1.36±0.03，LSD-t = 106.54; 4 h = 1.67±0.03，LSD-t = 314.24; 8 h = 1.90±0.04， LSD-t = 441.66; 16 h = 1.69±0.09， LSD-t = 70.48; 24 h = 1.47±0.04， LSD-t = 110.04，P均< 0.01），見圖3B。此部分結果提示丁酸鈉處理可通過對線粒體復合體的作用，進而刺激細胞線粒體相關功能。

四、丁酸鈉通過抑制PDE3B導致p-CREB表達，激活cAMP通路

cAMP通路在線粒體發揮各項生理功能時具有重要影響。由于丁酸鈉已被證實可促進線粒體生成及功能，我們選取控制線粒體生成和調控的相關通路cAMP通路進行研究。使用丁酸鈉及對cAMP通路抑制的forskolin處理細胞，8 h后收取細胞提取RNA檢測PDE3B轉錄情況，發現丁酸鈉可顯著降低PDE3B轉錄，而forskolin對PDE3B轉錄具促進作用（與對照組比較，丁酸鈉組 = 0.50±0.06，LSD-t = 8.99， P < 0.01;forskolin = 2.35，LSD-t = 3.49，P = 0.04），見圖4A。使用1c1c7細胞，加入0.3 mmol/L棕櫚酸作為對照，以及0.3 mmol/L棕櫚酸+10 mmol/L丁酸鈉作為實驗組，培養8 h后進行RNA提取，發現棕櫚酸導致PDE3B表達升高，而使用丁酸鈉共培養后，PDE3B水平較單獨棕櫚酸組下降（與1 h 棕櫚酸組比較，1 h 棕櫚酸+丁酸鈉組 = 1.15±0.24，LSD-t = 0.54，P = 0.62; 8 h 棕櫚酸組 = 2.86±0.27，LSD-t = 12.59，P < 0.01; 8 h 棕櫚酸+丁酸鈉組 = 1.89±0.08，LSD-t = 8.82，P < 0.01; 8 h 棕櫚酸組與8 h 棕櫚酸+丁酸鈉組比較，LSD-t = 5.19， P = 0.01），見圖4B。進一步提取蛋白檢測通路相關的p-CREB及PDE3B，發現丁酸鈉可于蛋白水平上抑制PDE3B并促進p-CREB表達，見圖4C。實驗結果初步表明丁酸鈉可激活線粒體功能，并且可能是通過抑制PDE3B從而激活cAMP通路介導的，使用丁酸鈉處理細胞可減輕由棕櫚酸導致的線粒體功能下降。

討論

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是指除外酒精和其他明確的肝損害因素所致的，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變為主要特征的臨床病理綜合征[2]。NAFLD在我國成人的患病率為10% ～ 30%，近年發病率呈持續上升趨勢，現已成為我國最常見的慢性肝病之一[3]。

肝臟在能量代謝中有舉足輕重的作用，主導糖類、蛋白和脂肪的代謝，而線粒體是代謝中主要起作用的細胞器，因此有一部分理論認為，脂肪肝實質上可被歸為線粒體病[4-5]。線粒體主導細胞脂質的β-氧化、細胞的氧化磷酸化以及介導凋亡等[6]。NAFLD的發病中，肝臟經高脂處理后線粒體功能受損，并導致脂肪氧化、活性氧簇以及氧化壓力的變化，進一步表現為線粒體相關基因轉錄減少、線粒體呼吸鏈受損等，相關反應促進凋亡，導致脂肪氧化及能量產生減少[7]。cAMP是主導代謝及線粒體功能的主要通路之一，眾所周知，其可主導線粒體對脂肪的氧化，以及在代謝中的其他重要作用，如脂肪分解、糖異生等，且通過PGC-1α控制線粒體生成[8-9]。

近年來，肝-腸軸在內毒素對炎癥和代謝中的重要性越來越被重視。作為在腸道中占主要作用的短鏈脂肪酸，丁酸是研究相對充分的短鏈脂肪酸。初步研究表明其與改善腸道菌群及肥胖、胰島素抵抗狀態相關。我們的研究已經證實了在小鼠模型上使用丁酸鈉腹腔注射能減輕內毒素引起的肝臟損傷[10]。我們進一步研究發現，丁酸鈉能促進線粒體功能激活，主要表現為使ATP生成增加，并促進部分線粒體復合體蛋白表達。我們使用棕櫚酸+丁酸鈉共培養以模擬高脂所致非酒精性脂肪肝狀態下，使用丁酸鈉治療的效果。區別于棕櫚酸導致線粒體損傷以及線粒體相關PGC-1α的表達減低，使用丁酸鈉共培養能明顯促進PGC-1α較對照組的表達，并且激活脂肪氧化相關基因CPT1α。進一步我們通過檢測線粒體相關cAMP通路，發現使用丁酸鈉培養細胞后PDE3B抑制的同時p-CREB激活，這可能是丁酸鈉介導線粒體功能相關的分子機制。

丁酸鈉對細胞的作用是多方面的，我們的研究初步表明，在其作用下脂肪生成相關基因SREBP轉錄有明顯下降，這說明丁酸鈉可能通過不止一種機制改善細胞的脂肪代謝狀態。目前為止，丁酸鈉對代謝的研究多在動物實驗中進行，由于作為短鏈脂肪酸，丁酸鈉也具有脂肪酸的特性，培養細胞時可能導致細胞單純脂肪積累的增加，這點在以丁酸鈉誘導3T3-L1細胞成脂時已經有體現，然而脂肪肝的形成不僅是脂肪積累的變化，依據二次打擊學說甚至多次打擊學說，細胞脂肪積累后導致的炎癥狀態、線粒體損傷等是進一步導致脂肪肝進展的關鍵因素。我們采用細胞模型，意圖減少在動物模型上各器官和體內激素水平等反饋造成的整體效應。我們的研究結果表明丁酸鈉在肝細胞上可以增加ATP生成，促進線粒體生成相關基因PGC-1α的表達;使用棕櫚酸培養模擬高脂相關的脂肪肝模型，并加入丁酸鈉處理作為對照組，發現使用丁酸鈉后，線粒體和脂肪氧化相關的PGC-1α、CPT1α以至于脂肪生成的SREBP都較棕櫚酸組明顯變化，提示了丁酸鈉處理的細胞相對有更高的線粒體活性、脂肪氧化，以及更低的脂質生成。

本研究仍有待改進之處，我們的研究主要在細胞模型上進行，這可以更好地對細胞內的反應、通路進行控制，然而它在機體整體水平內丁酸鈉對代謝產生的效應仍需探究。另外，有其他研究表明丁酸鈉可能通過不止一方面的機制對代謝產生影響，有報道表明其通過抑制組蛋白乙酰化從而調控腫瘤生成相關基因[11]。有研究發現向懷孕及哺乳期母鼠食物添加丁酸鈉，其子代骨骼肌線粒體表達PGC-1α、GPR43和GPR41都明顯上升[12]。另有研究證實短鏈及中鏈脂肪酸在內皮及單核細胞內可增強線粒體功能以及線粒體呼吸能力，并可一定程度上抵抗炎癥反應帶來的線粒體損傷，具體通路未明，在肝臟中是否存在類似反應尚不明確，值得進一步研究[13]。同時我們也未能對線粒體各復合體以及氧化磷酸化進行系統的檢測，以確定丁酸鈉作用的具體靶復合體以及作用過程，這些都仍需深入研究。

綜上所述，本研究通過使用丁酸鈉培養肝細胞株1c1c7后檢測線粒體功能，以及對照丁酸鈉與棕櫚酸對1c1c7線粒體的作用，發現丁酸鈉可減輕棕櫚酸導致的線粒體功能下降，進一步發現丁酸鈉可通過抑制PDE3B激活cAMP通路，這可能是丁酸鈉介導線粒體功能變化的機制。這對脂肪肝治療的臨床應用可能起到一定的提示意義。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2019-06-28）

（本文編輯：楊江瑜）