維替泊芬對鼻息肉上皮細胞Yes相關蛋白的作用

李美嬌?鄧慧儀?王瑋豪?孔維封?袁田?邱惠軍?解子驍?黃雪琨?楊欽泰

【摘要】 目的 研究Ki-67和Yes相關蛋白（YAP）在鼻息肉組織中的表達，探討維替泊芬對人鼻息肉上皮細胞（hNPEC）增殖的影響。方法 實時熒光定量PCR及蛋白免疫印跡法分別檢測正常下鼻甲黏膜組織和鼻息肉組織的Ki-67和YAP的mRNA及蛋白水平。體外培養hNPEC，噻唑藍比色法（MTT）確定維替泊芬的半數抑制濃度（IC50），蛋白免疫印跡法檢測維替泊芬IC50處理組中Ki-67、YAP及TEAD1的蛋白表達，免疫熒光染色觀察Ki-67、YAP的細胞內表達。結果 在鼻息肉組織中， Ki-67和YAP的mRNA和蛋白表達均高于下鼻甲對照組，差異有統計學意義（P均< 0.05）。維替泊芬作用hNPEC 24 h后IC50為2.516 μmol/L。維替泊芬下調hNPEC中Ki-67及YAP、TEAD1的蛋白表達水平，差異有統計學意義（P均< 0.05）。免疫熒光染色顯示維替泊芬組中Ki-67陽性細胞數較少，YAP核內熒光強度明顯降低。 結論 維替泊芬可能通過抑制YAP-TEAD復合物來抑制hNPEC的增殖。

【關鍵詞】 鼻息肉;細胞增殖;維替泊芬;Yes相關蛋白;Ki-67

慢性鼻竇炎伴鼻息肉（CRSwNP） 是慢性鼻竇炎的一種類型，其病理學特征是黏膜慢性炎癥和上皮異常的組織重塑，目前已知上皮結構和功能異常包括增生和鱗狀化生，常因對其認識不足或治療不恰當等原因造成控制不佳[1-2]。鼻息肉是一種多因素炎癥性疾病，涉及多種細胞信號途徑和多種內型[3]。

Hippo-Yes相關蛋白（YAP）信號通路已被證實在細胞增殖、凋亡和分化的調節中起重要作用，并且可以調節發育、器官大小、組織穩態和腫瘤發生[4]。YAP為Hippo通路的主要效應分子，是發育和生理再生過程的關鍵調節因子，但如果失控，則可以誘導細胞轉化和癌癥進展[5]。在肺發育過程中，Hippo通路及其核心效應物YAP在氣道上皮細胞增殖和分化中起關鍵作用，提示在鼻息肉上皮中細胞增殖也可能與YAP密切相關[6]。

維替泊芬是一種光敏劑，研究發現維替泊芬作為非光敏劑會抑制YAP基因的轉錄和翻譯，能夠在沒有光激活的情況下破壞YAP-TEA結構域轉錄因子（TEAD）相互作用，而且維替泊芬會誘導增殖標志物如Ki-67、c-Myc或參與細胞周期進程的不同細胞周期蛋白表達的丟失，調控細胞增殖和凋亡[7-8]。但目前尚未見維替泊芬作用于人鼻息肉上皮細胞（hNPEC）的報道。本研究旨在探討YAP和Ki-67在正常鼻黏膜組織和鼻息肉組織中的表達差異，并初步探討維替泊芬對hNPEC增殖的影響，以期為鼻息肉的治療提供新的思路。

對象與方法

一、研究對象

鼻息肉標本20例納入鼻息肉組，來自2017年6月至2018年6月期間在我院住院手術治療的CRSwNP患者，診斷標準嚴格按照歐洲EPOS[1]。同期住院行鼻中隔偏曲矯正術，因術中暴露解剖結構的需要而切除的正常下鼻甲的10例患者納入下鼻甲對照組（表1）。所有患者均需停用全身或口服糖皮質激素至少1個月。排除標準：存在免疫缺陷、凝血功能異常、真菌性鼻竇炎或懷孕的患者。所有患者均已簽署知情同意書，并且已獲得醫院醫學倫理委員會同意。

二、RNA提取與實時熒光定量聚合酶鏈式反應

采用Trizol試劑提取鼻黏膜組織和hNPEC的總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒將每個樣品的總RNA（1 μg）逆轉錄為cDNA。通過ABI 7500 FAST儀器進行基因表達分析，檢測YAP、TEAD、和Ki-67的mRNA水平。使用7500實時PCR系統進行擴增，采用兩步法（在95 ℃下預變性30 s，然后在95 ℃下45次擴增5 s，60 ℃下擴增34 s）進行熔解曲線分析，以評價引物的特異性。引物序列見表2。用2-ΔCT方法計算基因的相對表達量。

三、蛋白免疫印跡法檢測

將鼻息肉及下鼻甲組織放入研缽研磨成粉末后，加入適量的裂解液，使用玻璃勻漿器研磨充分后4℃，12 000 g離心5 min，收集上清。按照BCA試劑盒操作說明檢測提取的蛋白濃度。充分混勻蛋白樣品與上樣緩沖液，沸水變性5 min。原代hNPEC用PBS液沖洗3次，用蛋白裂解液（RIPA）在冰上裂解細胞收集總蛋白，將15 μl蛋白在8% SDS-PAGE凝膠中電泳后轉移到PVDF膜上。 轉有蛋白的PVDF膜在5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，在單克隆抗體稀釋液（YAP為1∶1 000，Ki-67為1∶600，GAPDH為1∶3 000） 中4 ℃孵育過夜后，在濃度為1∶3 000的二抗中室溫孵育1 h， TBST清洗后在化學發光法（ECL）發光劑中顯影，自動凝膠成像系統采集圖像。用Qunatity One軟件處理分析條帶光密度值，以目的蛋白/內參的比值來表示蛋白的相對表達量。

四、hNPEC體外分離和原代培養

新鮮的鼻息肉組織新鮮標本，用含補充青霉素、鏈霉素和兩性霉素的PBS反復沖洗，以清除分泌物和骨頭，加入2倍于組織體積的DispaseⅡ 酶，4 ℃消化過夜。次日組織懸液用含有0.25% EDTA的胰酶孵育消化15 min，用含10%胎牛血清的1640培養基研磨3次，制成單細胞懸液，在無血清支氣管上皮細胞生長培養基（BEGM）中培養7 ～ 10 d，細胞密度達到85% ～ 90%時按實驗要求處理細胞。

五、噻唑藍比色法（MTT）試驗

hNPEC接種于96孔板，每孔100 μl，細胞數104個/孔，37 ℃培養4 ～ 5 d至細胞貼壁。分3組：對照組不加維替泊芬，不同濃度維替泊芬（0、1.25、2.50、5.00、10.00 μmol/L）組，每個劑量組合設6個復孔。細胞經維替泊芬處理后，在暗室37 ℃環境下分別溫育12、24、48 h，加入5 mg/ml MTT，每孔10 μl，37 ℃溫育4 h，每孔加入三聯液（SDS 10 g，異丁醇5 ml，10 M HCl 0.1 ml）150 μl，振蕩10 min之后37℃過夜，酶標儀檢測570 nm處的吸光度（OD）值。實驗重復3次，結果取平均值。

六、細胞免疫熒光

將hNPEC鋪板至24孔板內多聚賴氨酸處理的細胞爬片上，調整細胞數104個/孔，待細胞貼壁后取出使用PBS清洗3次， 4%多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗后加入一抗（YAP濃度為1∶100，Ki-67濃度為1∶800）4 ℃孵育過夜，PBS沖洗后加入熒光二抗（1∶400）37 ℃孵育1 h，PBS沖洗后加入DAPI常溫孵育5 min，封固后熒光顯微鏡下觀察拍照。

七、統計學處理

所有試驗數據采用SPSS 20.0進行分析。正態分布連續性定量資料以表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗;非正態分布定量資料用中位數（上、下四分位數）表示，組間比較用秩和檢驗。定性資料組間比較采用Fisher確切概率法。P < 0.05為差異有統計學意義。采用Graphpad 7.0軟件繪圖。

結 果

一、Ki-67及YAP在下鼻甲和鼻息肉中的表達

實時熒光定量PCR結果顯示，下鼻甲（n=10）和鼻息肉（n=20）中均可檢測到Ki-67和 YAP的mRNA表達，而鼻息肉組Ki-67和YAP的 mRNA表達均高于下鼻甲對照組，組間差異有統計學意義（Z= -2.684， P=0.006; Z=-2.090， P=0.035， 圖1）。

同時，蛋白免疫印跡法結果也顯示，下鼻甲（n=4）和鼻息肉（n=6）中均可檢測到Ki-67和YAP蛋白表達，并且鼻息肉中Ki-67和YAP蛋白的表達均高于下鼻甲對照組，組間差異有統計學意義（t=-2.767， P=0.028;t=-2.454， P=0.040， 圖2）。

二、維替泊芬對hNPEC增殖的影響

采用MTT實驗檢測維替泊芬是否影響hNPEC的增殖水平。用不同濃度的維替泊芬（0、1.25、2.50、5.00、10.00 μmol/L）處理hNPEC，分別處理12、24、48 h后予MTT檢測。結果表明，維替泊芬以濃度和時間依賴的方式抑制細胞增殖活力（n=3， 圖3A）。根據MTT測定結果，維替泊芬處理hNPEC 24 h時的IC50值為2.516±0.246 μmol/L （n=3， 圖3B），后續實驗將直接采用維替泊芬的IC50。

三、維替泊芬對hNPEC YAP表達的影響

蛋白免疫印跡法結果顯示，分別用0、2.516 μmol/L維替泊芬處理hNPEC 24 h后，YAP （t=4.536， P=0.011）及其轉錄因子TEAD1（t=9.732， P=0.001），Ki-67（t=4.114， P=0.015）的表達水平降低（n=3， 圖4）。

免疫熒光實驗顯示，鼻息肉組織中YAP分布在細胞核和細胞質內，其中主要在核內分布;2.516 μmol/L維替泊芬處理hNPEC后，Ki-67陽性細胞數減少，而YAP在hNPEC中的定位無明顯變化，但核內熒光強度明顯降低（圖5）。

討 論

Hippo信號通路在哺乳動物細胞中高度保守，作為Hippo信號轉導通道的下游重要轉錄激活因子，YAP是Hippo通路中的關鍵蛋白，已被證實調控多種基因的表達，起到調節細胞增殖、凋亡、器官發育和修復等作用[9]。

已有文獻證明鼻息肉組織中的上皮細胞增殖率高于正常鼻黏膜[10]。Ki-67核抗體作為評價細胞增殖的預后標志物已廣泛使用數十年，鼻息肉重塑的上皮中Ki-67陽性細胞增多[11]。本研究發現與正常下鼻甲黏膜組織相比，YAP在鼻息肉組織中的表達顯著增加，同時增殖標志物Ki-67表達上調，提示YAP可能具有促進hNPEC增殖的作用[12]。

作為一種光敏劑，維替泊芬以往被廣泛且安全地用于新生血管性黃斑變性以及多種人類腫瘤[13]。近些年來，大量的研究發現維替泊芬作為非光敏激活劑時也有至關重要的治療作用[14]。本研究的MTT實驗結果顯示，維替泊芬根據濃度和時間依賴性的方式抑制hNPEC的增殖，并且進一步通過蛋白免疫印跡法和免疫熒光檢測Ki-67證實，提示維替泊芬可抑制hNPEC的增殖。

已報道YAP可與多種轉錄因子結合，包括對細胞發育和癌癥進展至關重要的TEAD[5]。一些研究表明YAP作為Hippo通路的核心效應蛋白，通過與TEAD蛋白的相互作用，可以觸發靶基因如Areg的轉錄，從而促進多種腫瘤細胞的增殖[7]。此外，gp130信號通過激活YAP促進腸上皮細胞增殖，導致抵抗黏膜浸潤[15]。而維替泊芬可能通過破壞YAP-TEAD復合物和預防YAP誘導的致癌性生長，從而對多種腫瘤生長具有直接抑制作用，這一過程，可以是通過誘導細胞自噬或凋亡，又或者是影響細胞分化[8，16-21]。在我們的研究中，維替泊芬處理后的hNPEC中YAP、TEAD1和Ki-67的表達明顯降低，結果提示維替泊芬對鼻息肉的抑制作用有可能是通過下調YAP、TEAD，從而抑制Ki-67的表達。

綜上所述，維替泊芬在體外可以抑制hNPEC的生長和增殖，并且這種細胞生長的抑制可能與YAP-TEAD復合體的干擾相關。YAP可能參與鼻息肉的發病過程，是治療鼻息肉的潛在靶點。根據本研究結果可推測維替泊芬可以作為鼻息肉的潛在治療方法。但其具體的作用機制仍需要進一步的深入研究。

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（收稿日期：2018-10-16）

（本文編輯：楊江瑜）