LED光源照射對人皮膚成纖維細胞的影響

胡曉劍，陳澤慶，周小麗，劉木清

(1.復旦大學光源與照明工程系，上海 200433；2.先進照明技術教育部工程研究中心，上海 200433)

引言

光療是利用光線的輻射能治療疾病的一種理療法。自人工光源被發明以來，光療在醫療領域得到了相應的應用和發展。在各類疾病的治療中，光療主要作為輔助療法，實現傷口愈合、殺菌治療等作用[1-3]。光療難以廣泛應用的原因，一是人體內部的疾病難以引入光療手段，二是由于在細胞生長的條件中光照并非必要條件，因此理論依據不足。皮膚作為人體面積最大的器官，長期暴露在光照環境下，皮膚細胞的生長會受到不同光照條件的影響。因此，研究光照對皮膚細胞的影響具有重要的意義。

過去的光療通常采用激光光源，然而激光光源原理和結構較為復雜，成本較高，因此在使用上受到很多的限制[4, 5]。LED光源具有壽命長、結構簡單、體積小、易控制等特點，與激光相比作為光療應用的光源有著潛在的優勢。本文通過實驗研究了LED光源在不同條件下對人皮膚成纖維細胞的影響，為光療在皮膚類疾病上的應用提供參考。

1 實驗準備

1)人皮膚成纖維細胞。成纖維細胞是疏松結締組織的主要細胞成分，由胚胎時期的間充質細胞分化而來，細胞活動旺盛，具備明顯的蛋白質合成和分泌作用，在一定條件下可以實現與纖維細胞的互相轉化，因此成纖維細胞對于不同程度的細胞變性、壞死和組織缺損、創傷的修復具有重要的作用。人皮膚成纖維細胞是皮膚真皮的主要組成部分，其可合成和分泌膠原纖維、彈性纖維、網狀纖維、透明質酸等細胞外基質，對于保持皮膚強度和彈性、修復損傷及美容美體具有重要作用，是維持皮膚年輕態的決定性因素，也是維持皮膚結構穩定的重要組成部分[6, 7]。

2)實驗裝置。相關研究表明，波長范圍為380～780 nm的可見光對人皮膚成纖維細胞都有不同程度的影響[8-11]。本文在380～780 nm波長范圍內選擇5種典型波長LED作為照射光源，對培養在96孔細胞培養板中的人皮膚成纖維細胞進行照射，測定光照后的細胞活性，探究光照對人皮膚成纖維細胞的影響。通過設計以ZXLD1370驅動芯片為核心的LED驅動電路，采用14顆3 W大功率LED作為光源，在燈具表面配上光學透鏡進行勻光，實現光強的均勻分布[12]。以ZXLD1370芯片為核心的LED驅動電路如圖1所示。

圖1 以ZXLD1370為核心的LED驅動電路示意圖Fig.1 LED driver circuit based on ZXLD1370 driver

在ZXLD1370芯片的引腳中，V+與V-引腳用于接收外界的電源信號，為控制電路和發光電路提供電源。FB與SENSE引腳之間通過電子元器件構成一個內部電路，通過元器件的不同參數選擇改變輸出恒流的大小。LED+與LED-引腳用于連接LED發光電路使其發光。通過給ADJ施加信號，以線性調光方式輸出穩態光。在實驗前使用Thorlabs PM100D光功率計和S170C探頭進行光功率密度的測量，將光功率密度設置為20 mW/cm2，實驗用的5種LED使用遠方SPIC-2000型號手持式照度計測定峰值波長，5種不同類型LED的峰值波長如表1所示。

表1 實驗用LED的波長

由于細胞的培養過程中需要穩定的溫濕度、CO2濃度和無菌的環境，因此細胞在培養過程中都是放置于細胞培養箱中生長的。細胞培養過程中同時施加以上的光照條件。

3)細胞培養。取液氮凍存中的人皮膚成纖維細胞，按細胞復蘇的標準流程操作，于37 ℃溫水中迅速解凍后，離心棄去上清液，加入含10%FBS，1%雙抗的高糖DMEM培養基培養在25 cm2細胞培養瓶中，于5%CO2、37 ℃、95%相對濕度的細胞培養箱中培養，并日常觀察細胞狀態。待到顯微鏡下觀察視野范圍內細胞達到80%匯合程度時，即可進行傳代培養。細胞傳代培養時，使用0.25% Trypsin-EDTA將細胞從培養瓶中消化至脫落，轉移到離心管中以1 000R的轉速離心5 min，將離心后的細胞棄去上清液，使用含10%FBS，1%雙抗的高糖DMEM培養基重懸，之后根據實驗需求按細胞數目重新放置到25 cm2培養瓶中培養或是接種到96孔細胞培養板上準備實驗[13, 14]。

4)主要設備。實驗使用的主要設備包括兆信KXN-645D直流電源、飛逸FY2300-02M信號發生器、Thorlabs PM100D光功率計、Thorlabs S170C光功率探頭、Olympus CKX53倒置顯微鏡、Heal Force AlphaClean 1300超凈工作臺、啟前QQ-80A-II二氧化碳培養箱、瑞江RJ-TGL-1600R離心機、上海鉆石803機械秒表、Thorlabs MultiScan酶標儀。

5)主要試劑。實驗使用的主要試劑包括HyClone DMEM高糖培養基、Gibco FBS(烏拉圭來源)、HyClone PBS、Gibco 0.25% Trypsin-EDTA、Gibco Penicillin Streptomycin。

2 生長曲線實驗

細胞的生長速度并不是固定的，而是隨著培養條件、細胞數目、細胞狀況等一系列條件發生變化。細胞的生長分為潛伏期、生長期、平臺期和衰退期。其中潛伏期細胞生長緩慢，平臺期細胞接近停止生長，衰退期細胞開始凋亡，而生長期的細胞生長狀況旺盛，適合用于實驗。因此在光照試驗前，需要先測定細胞的生長曲線，確定細胞的生長期，以便于之后的實驗選擇生長期的細胞進行光照試驗。

細胞的生長曲線一般有兩種測定方法，一種是細胞計數法，另一種是CCK-8法。由于細胞計數法誤差較大，因此一般用于簡單觀測生長趨勢，我們采用更加精確的CCK-8法進行生長曲線測定[15]。

采用CCK-8法測定生長曲線時，將細胞以每孔1 000個的數量接種到96孔板中，共計接種54孔，并每孔補足0.1 mL培養基。除此之外，再選定6孔每孔加入0.1 mL不含細胞的培養基，作為對照。處理完成后，將96孔板放入細胞培養箱進行培養。24 h后取出96孔板，向其中6個孔加入1單位CCK-8試劑，充分混勻后重新放入培養箱培養1 h，之后取出并在酶標儀上讀取位于450 nm處的吸光度值(optical density, OD)。以后每隔24 h取6個孔進行相同操作，可以獲得8 d的細胞生長數據。實驗過程中定期觀察，及時補充新的培養基。實驗所用的96孔板如圖2所示，測得的數據如表2所示。

在數據處理時，為了減小誤差，去掉一個最高和一個最低值，對數據進行處理得到相對細胞活性如表3所示。

圖2 實驗用96孔細胞培養板Fig.2 96-well cell culture plate used in experiments

表2 生長曲線實驗每天樣品的吸光度

表3 生長曲線實驗中的相對細胞活性

根據數據作折線圖得到細胞生長曲線，如圖3所示。可以看出，人皮膚成纖維細胞在1～2天處于潛伏期，生長較為緩慢，從第3天開始生長速度明顯加快，一直到第6天都能保持快速增長，而從第7天開始進入平臺期，增長速度明顯下降，在8天的測試中沒有觀測到明顯的衰退期，推測衰退期應該在第9天及以后出現。因此可以總結出人皮膚成纖維細胞的生長期為3～6天，由此得出應取傳代后3～6天的細胞進行光照實驗。

圖3 人皮膚成纖維細胞細胞生長曲線Fig.3 Cell curve of growth for human fibroblasts

3 光照實驗

3.1 不同波長光照實驗

取培養瓶中80%匯合的細胞進行接種操作，準備6個96孔板，每個六孔板接種6個孔，按照每孔1 000細胞的密度進行接種。其中A組在接種6孔細胞之后，再選6個孔，加入0.1 mL不含細胞的培養基，作為CCK-8測試的空白對照。將所有96孔板放入細胞培養箱中培養3 d后進行光照試驗，各個實驗組的光照條件如表4所示。

表4 不同波長光照實驗設置的光照參數

表4中A為對照組，不進行光照，B～F為實驗組，保持光照強度相同，時間相同，進行不同波長的光照。實驗步驟如下：

1)調節培養箱參數使其達到適合細胞生長的溫濕度和CO2濃度；

2)安裝實驗燈具，調節并測定光強，待燈亮10 min后再次測定光強，確保光強沒有衰減；

3)放入96孔板進行光照，計時30 min；

4)取出96孔板，放入無光照培養箱中繼續培養24 h；

5)取出96孔板，向實驗孔中加入1個單位CCK-8試劑，混勻后放入培養箱中培養1 h；

6)使用酶標儀讀取96孔板在450 nm處的OD值，并與對照組進行對照，得出細胞活性的數據。

3.2 不同時長光照實驗

選擇波長為630 nm的紅光LED，探究光照時間對人皮膚成纖維細胞活性的影響。

取培養瓶中80%匯合的細胞進行接種操作，準備6個96孔板，每個六孔板接種6個孔，按照每孔1 000細胞的密度進行接種。其中A組在接種6孔細胞之后，再選6個孔，加入0.1 mL不含細胞的培養基，作為CCK-8測試的空白對照。將所有96孔板放入細胞培養箱中培養3 d后進行光照試驗，各個實驗組的光照條件如表5所示。

表5 不同時長光照實驗設置的光照參數

表5中A為對照組，不進行光照，B～F為實驗組，保持波長相同，光照強度相同，進行不同時間長度的光照。實驗步驟如下：

1)調節培養箱參數使其達到適合細胞生長的溫濕度和CO2濃度；

2)安裝實驗燈具，調節并測定光強，待燈亮10 min后再次測定光強，確保光強沒有衰減；

3)放入96孔板進行光照，按照實驗時間進行計時；

4)取出96孔板，放入無光照培養箱中繼續培養24 h；

5)取出96孔板，向實驗孔中加入1個單位CCK-8試劑，混勻后放入培養箱中培養1 h；

6)使用酶標儀讀取96孔板在450 nm處的OD值，并與各實驗組進行對比分析，得出細胞活性的數據。

4 實驗數據及分析

4.1 實驗數據

不同波長光照實驗中，用酶標儀測得的數據如表6所示。

在不同時長光照實驗中，用酶標儀測得的數據如表7所示。

表6 不同波長光照實驗的樣品吸光度

表7 不同時長光照實驗的樣品吸光度

4.2 數據處理及分析

實驗中采用CCK-8法測定細胞的活性[16]。CCK-8法是用于測定細胞增殖或毒性實驗中活細胞數目的一種高靈敏度，無放射性的閉塞檢測法。CCK-8利用了Dojindo開發的水溶性四唑鹽—WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽), 它在電子載體1-Methoxy PMS存在的情況下能夠被還原成水溶性的甲臜染料。WST-8被細胞內脫氫酶氧化還原后生成橙黃色甲臜染料能夠溶解在組織培養基中，生成的甲臜量與活細胞的數量成正比。由于使用酶標儀檢測，獲得的數據為吸光度，計算公式為：

(1)

其中η為相對細胞活性，As為實驗孔(含有實驗組細胞，培養基，CCK-8)數據，Ac為對照孔(含有對照組細胞，培養基，CCK-8)數據,Ab為空白孔(含有無細胞培養基，CCK-8)數據。

實驗中的所有數據均使用GraphPad Prism 7.0軟件進行分析和作圖。

4.2.1 不同波長對人皮膚成纖維細胞影響的分析

首先將酶標儀測得的吸光度數據按照計算公式轉換為相對細胞活性的數據，在數據處理時，為了減小誤差，去掉一個最高值和一個最低值，對數據進行處理得到相對細胞活性。處理后的數據如表8所示。

表8 不同波長光照實驗的相對細胞活性

根據表格繪柱狀圖，x坐標為不同波長的實驗組，其中Ctr表示無光照的對照組，y坐標為相對細胞活性，如圖4所示。

圖4 不同波長光照對細胞的影響Fig.4 Cell proliferation under different wavelength test

從圖4中可以看出，不同波長的LED對人皮膚成纖維細胞具有不同影響。其中相對于無光照的對照組，在384 nm、418 nm、457 nm波長下細胞活性下降，其中384 nm波長下細胞活性下降最為明顯，而457 nm波長對細胞活性的影響比較輕微。而526 nm、630 nm波長下細胞活性相對于無光的對照組增強，其中526 nm波長相對于無光對照組的細胞活性略有增強，而630 nm波長實驗組的細胞活性增強更為明顯。

不同的效果為我們的應用提供了多方位的選擇。例如在選擇去除增生組織的要求中，我們可以選擇384 nm波長的LED光源，使多余的人皮膚成纖維細胞生長受到抑制；而在皺紋修復的要求中，我們可以選擇630 nm波長的LED光源，使局部的人皮膚成纖維細胞活性增加，從而更快生長填滿皮膚溝壑，達到修復的目的。

4.2.2 不同時長對人皮膚成纖維細胞影響的分析

首先將酶標儀測得的吸光度數據按照計算公式轉換為相對細胞活性的數據，在數據處理時，為了減小誤差，去掉一個最高和一個最低值，對數據進行處理得到相對細胞活性。處理后的數據如表9所示。

表9 不同時長光照實驗的相對細胞活性

根據表9繪制折線圖，x坐標為不同照射時長，其中對照組由于無光照，因此可以視為照射時長為0，y坐標為相對細胞活性，如圖5所示。

圖5 不同時長光照對細胞的影響Fig.5 Cell proliferation under different radiation length test

從圖5可以看出，隨著照射時長的增加，細胞活性變強，但細胞活性增強的趨勢逐漸平緩。在光照時間小于30 min時，細胞活性隨光照時間增加有較為明顯的提升，而在光照時間超過30 min之后，細胞活性的水平趨于穩定。從實際治療的角度來看，對一個患病部位進行過長時間的照射會導致病人的體驗不佳，且無法獲得更加顯著的效果。因此本文認為，在光功率密度為20 mW/cm2的情況下，采取30 min的照射時長是比較合適的治療方案。

5 結論

我們通過實驗驗證了LED對人皮膚成纖維細胞具有一定的影響，實驗的數據表明，不同波長的LED照射人皮膚成纖維細胞會對細胞產生不同的影響，其中波長為384 nm、417 nm、457 nm會降低細胞活性，而波長526 nm、630 nm會提升細胞活性，即若要抑制細胞生長，應選擇384 nm波長，若要促進細胞生長，則應選擇630 nm波長。當選擇促進細胞生長的630 nm波長進行實驗時，可以從實驗結果看出，照射時間越長，細胞活性的提升越大，在初步實驗的參數設置中，可以看出在強度為20 mW/cm2的情況下，30 min的照射時間是較為適宜的。在后續的研究中，可以著重探討的問題還有不同光強對于人皮膚成纖維細胞的影響等。本文的研究僅針對LED對體外培養的人皮膚成纖維細胞的影響得出初步結論，至于LED對人皮膚的影響效果是否與體外實驗一致，還需進一步的研究。