“青霉菌培養與觀察”實驗探討

劉雅清 杜 娟 徐 娟

（華東師范大學第二附屬中學附屬初級中學 上海 200241）

“青霉菌培養與觀察”是《上海市中學生生命科學課程標準》初中階段主題3“生物的主要類群”中“微生物”部分的實驗內容。教材中提供的培養青霉菌的方法是將新鮮橘皮置于溫暖、潮濕的環境培養1 周左右，橘皮上長出的青綠色的菌落即為觀察對象。利用該培養方法得到的青霉菌往往過于成熟，很難找到基內菌絲或營養菌絲及產孢子結構共存的最佳視野，往往看到的都是高密度散落的綠色孢子。在青霉菌的觀察方法上，教材中指導學生利用解剖針或者鑷子挑取少許菌絲放在水滴中，制成臨時裝片在顯微鏡下觀察。而此觀察方法對學生的操作技術要求較高，且孢子很容易散落，較難觀察到完整的青霉菌產孢子結構。

為了解決上述培養、觀察青霉菌方法中存在的問題，本實驗對青霉菌的培養和觀察方法進行了改進。首先，觀察用的青霉菌皆來源于利用PDA 培養基在實驗室培養所得的培養平板，利用PDA 培養基極大縮短了青霉菌的培養時間，經過多次實驗也得到了觀察青霉菌形態結構的最優培養時間。其次，優化了制作青霉菌臨時裝片的方法，采用透明膠帶粘附法使學生較易制得目標裝片，并觀察到完整的青霉菌結構，降低了實驗操作難度，縮短了實驗操作時間。最后，全部的實驗操作過程中，青霉菌始終生長在培養皿基質內，避免了霉菌孢子散落在空氣中被學生吸入而引發身體不適，并且也方便實驗結束后的菌種保藏和霉菌處理。

1 實驗材料

土豆、紗布、葡萄糖、橘皮培養的青霉菌原始菌種、涂布棒、無菌水、無菌平皿、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、透明膠帶、剪刀、鑷子、吸水紙、紗布等。

實驗環境：顯微數碼互動實驗室。

2 青霉菌的培養

2.1 PDA 培養基的配制 土豆洗凈去皮切成小塊,稱取200 g 加水煮爛（煮沸20 min，能被玻璃棒戳破即可）。用8 層紗布過濾，濾液中加入20 g葡萄糖，攪拌均勻，再補足水分至1 L，分裝錐形瓶。按照1.5%～2%的比例稱量瓊脂并分裝到錐形瓶中，加塞、包扎，115℃滅菌30 min，搖勻，冷卻至55℃左右倒平板，備用。

2.2 青霉菌的接種 在超凈工作臺中，用滅菌后的涂布棒將橘皮上的青霉菌原始菌種轉到裝有20 mL 無菌水的平皿中，混勻制成孢子液；利用涂布棒將上述制得的菌液接種到若干PDA 固體平板中。

2.3 青霉菌的培養條件 將接種好的青霉菌固體平板置于28℃恒溫培養箱培養30 h，培養箱內保持一定濕度。具體培養時間以青霉菌長勢情況為準，最佳長勢為白色菌落上剛剛呈現出綠點，此時終止培養并置于冰箱冷藏備用。由于青霉菌在冷藏狀態下仍然保持低速繁殖的模式，所以冷藏備用的時間不能超過48 h。

2.4 青霉菌菌種保藏方法 待培養皿中青霉菌菌落成熟后（綠色菌落），用保鮮膜或者封口膜包扎好置于冰箱冷藏，可保存數年，使用前取出轉接新配制的PDA 培養基活化即可［1］。

3 青霉菌的顯微觀察

3.1 臨時裝片的制作 剪一條1～2 cm 長的透明膠帶，輕輕沾取青霉菌培養皿中略帶有綠色孢子的白色菌絲部分（切勿用手按壓膠帶），將沾有青霉菌的膠帶粘在載玻片上。沾取青霉菌后立即蓋好培養皿蓋，以防吸入大量孢子。

3.2 顯微觀察方法 將臨時裝片置于顯微鏡載物臺上，在10 倍物鏡下尋找帶有“掃帚”樣的青霉菌產孢子結構的物像，將該物像調至視野中央，換40 倍物鏡觀察。

3.3 觀察結果呈現

圖1 青霉菌顯微圖像（10×40 倍）

圖1 為10×40 倍放大倍數下青霉菌的顯微圖像，可以清楚地觀察到完整的“掃帚”樣產孢子結構及直立的分生孢子梗，且能追蹤到“掃帚”樣產孢子結構頂端即將散落和已經散落的分生孢子。

4 教學效果討論

從學生觀察到的青霉菌顯微圖像結果呈現來看，視野中能清晰地看到青霉菌“掃帚”樣產孢子結構及直立的分生孢子梗，且能追蹤到“掃帚”樣產孢子結構頂端成串的成熟孢子即將散落的過程，幫助學生更好地理解為什么操作過程中要盡量避免空氣流通，以防吸入大量孢子。青霉菌在固體培養基中要經歷3 個生長階段：第1 階段是基內菌絲和氣生菌絲的生長；第2 階段在氣生菌絲上長出直立的分生孢子梗，繼而在分生孢子梗頂端形成成串的孢子，此結構即為顯微鏡下能觀察到的“掃帚”樣產孢子結構；第3 階段孢子會大量繁殖，密集地覆蓋在氣生菌絲上［2］。觀察青霉菌的最佳時期是當青霉菌生長至第2 階段初期，此時在直立的分生孢子梗的頂端剛好形成成串的孢子，進行顯微觀察時視野中有大范圍能夠鎖定目標的觀察物，而此階段經歷的時間非常短，僅停留幾小時［1］，所以優化青霉菌的培養是非常必要的，本實驗很好地解決了該問題。

本實驗在青霉菌的觀察方法上做了改進，利用膠帶粘附的方法大幅降低了學生操作的難度，使其有充足的時間觀察菌絲和產孢子結構，從上述結果呈現來看實驗效果很好。同時，膠帶粘附法可以將菌體生長的狀態完好地保留下來，避免了因青霉菌孢子在制作裝片過程中的散落而影響觀察效果。