李種質資源ISSR反應體系引物篩選

安佰義 王迦 王嫚 于慧穎 范愛淇 張艷波 張艷 李鋒

摘要：以李18個品種種質資源為試驗材料，對其開展ISSR反應體系引物篩選，結果表明，從41個隨機引物中篩選出25個多態性引物用于PCR擴增，每個多態性引物擴增出的條帶數在8～23條之間，擴增出的DNA片段長度大多在150～2 400 bp 之間;共擴增出條帶數為385條，其中，樣品間相同的條帶數有53條;所選引物的多態位點百分率為86.23%。

關鍵詞：李;種質資源;ISSR;引物;多態位點

中圖分類號： S662.302.4? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0063-03

區間簡單重復序列標記（inter-simple sequence repeat，ISSR）是一種微衛星基礎上的第2代分子標記技術，其基本原理是用錨定的微衛星DNA為引物，在簡單重復序列（SSR）的3′端或5′端各加2～4個非重復隨機核苷酸序列作為引物，在聚合酶鏈式反應（PCR）中錨定引物可引起特定位點退火，并對重復序列間的DNA片段進行PCR擴增[1-3]。ISSR標記結合了隨機擴增多態性DNA標記（RAPD）、SSR技術的優點，具有模板DNA用量少、引物設計簡單、成本低、PCR擴增產物多態性豐富、產物重復性和穩定性好、試驗安全性較高及技術難度較低等特點[4]，現已在植物遺傳作圖、基因定位、品種鑒定、遺傳多樣性及親緣關系分析等方面被廣泛應用[5-9]。

我國是李的起源地之一，有著非常豐富的李種質資源，是李種質遺傳多樣性中心[10]。李是優良的蜜源植物，其葉簇、花朵、果實有一定的觀賞價值，可作庭園綠化樹種[11]。中國李對土壤要求不嚴格，適應性好，生長迅速，結實期早，產量高，抗灰腐病力強，果實耐貯藏，被世界各國引種栽培，并作為培育李的重要親本，而在長期選育過程中，李的親緣關系復雜[12]。本試驗對李種質資源基因組進行ISSR-PCR擴增，以期篩選出擴增良好的引物，對李種質資源親緣關系的鑒定及研究能提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

18份李種質資源，由國家果樹種質公主嶺寒地果樹資源圃提供，試驗編號及種質名稱見表1。試驗引物共41個（表2），參照哥倫比亞大學公布的ISSR引物序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 植物基因組DNA的提取

采用十二烷基苯磺酸鈉（SDS）法提取植物基因組DNA。2016年5月，自李樹剛萌發的新梢上采集幼嫩葉片 液氮速凍，置于-80 ℃冰箱中保存，備用;取適量葉片，液氮條件下研磨至粉末狀，裝于2 mL離心管，加入Buffer A提取液，立即混勻;65 ℃水浴16 min，其間搖動離心管2次;取出離心管，冷卻至室溫，加入體積比為25 ∶ 24 ∶ 1的酚、三氯甲烷、異戊醇混合液800 μL，輕輕搖勻2～3 min;12 000 r/min離心 8 min，上清轉移至1.5 mL離心管中，盡量不要觸動中間蛋白層;加入 0.7 倍體積的異丙醇至上清液中，輕輕混勻，直至絮狀沉淀產生;用毛細管勾出絮狀沉淀，轉移至裝有200 μL 70%乙醇的1.5 mL離心管中進行洗滌;吸干離心管中乙醇，DNA在管中自然晾干;加入200 μL含RNA酶的1×TE緩沖液以充分溶解DNA，4 ℃或-20 ℃保存，備用。

1.3 PCR擴增與電泳檢測

反應體系總體積為10 μL，分別為10×上樣緩沖液（loading buffer）1 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.2 μL，0.4 μmol/L引物（Primer） 0.4 μL，5 U/μL Taq酶0.1 μL，50 ng/μL DNA模板2 μL，用雙蒸水補足10 μL。擴增程序參照文獻[12]，并稍作修改，95 ℃預變性4 min;95 ℃變性30 s，45～61 ℃退火 45 s（退火溫度見表2），72 ℃延伸2 min，共34個循環;72 ℃延伸10 min。擴增產物4 ℃保存，經2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳液為1×TAE緩沖液，DL 2000為DNA分子量標準，電壓為135 V，電泳時間為50 min;電泳結果采用凝膠成像系統拍照記錄，每個引物的擴增產物呈穩定而清晰的條帶作為統計數據，有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”;將數據輸入計算機，對其進行統計分析。

2 結果與分析

由圖1、圖2、圖3可見，不同的生物基因組可使用同1個引物，而對某一特定的基因組，不同引物的擴增效率是不同的，引物擴增效率的高低由其產生的多態性條帶數決定。由表3可見，41個引物中可篩選出25個多態性高的引物用于擴增，這25條引物分別為UBC807、UBC810、UBC811、UBC812、UBC815、UBC818、UBC821、UBC825、UBC827、UBC834、UBC835、UBC836、UBC841、UBC842、UBC843、UBC844、UBC845、UBC846、UBC847、UBC848、UBC856、UBC857、UBC859、UBC873、UBC881;25個多態性引物對18份李種質資源進行PCR擴增，擴增出的條帶數在8～23條之間，擴增出的分子量大多在150～2 400 bp之間;共擴增出條帶數為385條，其中樣品間相同的條帶數有53條，呈多態性的條帶數為332條，平均多態位點百分率為86.23%;擴增出的多態性條帶占比在55.56%～100.00%之間，其中，引物UBC812、UBC815、UBC821、UBC844、UBC848、UBC881擴增出的條帶多態性相對較好，多態性條帶占比達到100.00%。

3 結論與討論

目前，應用分子生物學技術對李種質資源的研究已取得較大進展。ISSR分子標記技術具有操作簡單、可靠性強、重復性高等特點，但運用ISSR分子標記技術時，每個引物在不同物種上的擴增效率不同，引物的多態性水平越高，則說明物種的種質資源越豐富。因此，針對不同物種篩選出條帶清晰、穩定性高的引物是必不可少的[13]。本試驗篩選出的引物多態性程度相對較高，平均多態位點百分率為86.23%，說明李種質資源的遺傳基礎較為廣泛，種質資源較為豐富，這可能與我國是李屬植物的起源中心且自然分布較廣有關;從41個引物中篩選出的25個引物能夠很好地反映出供試李種質資源的差異性，擴增出的條帶多態性占比在55.56%～100%之間，其中，引物UBC812、UBC815、UBC821、UBC844、UBC848、UBC881擴增出的條帶可用于多態性標記，與劉威生等的研究結果[9，14]基本一致。