不同鈣處理對2份海南花生種質資源農藝性狀和防御酶系統的影響

李東霞 符海泉 楊偉波 徐中亮

摘要：研究施鈣和未施鈣處理對2份海南花生種質資源WC1和WC9的農藝性狀和活性氧防御酶系統的影響，初步解析花生表現耐低鈣的原因，為今后選育適宜海南種植的耐低鈣花生新品種奠定基礎。以在海南收集的花生種質資源為材料，采用土壤盆栽的培養方法，設置施鈣和未施鈣2個處理，研究2份海南花生種質資源的株體性狀、生產性能性狀，果實不同發育時期活性氧防御酶系統的差異性。結果表明，未施鈣處理下，WC9的主莖高、總分枝數、結果枝數顯著大于施鈣處理下的主莖高、總分枝數、結果枝數。在未施鈣處理下，WC9的干果質量、飽果干質量、百果質量和出仁率均大于WC1。在未施鈣處理下，幼果2期WC1樣品中CAT、SOD活性顯著高于WC9，WC9樣品中的POD活性顯著高于WC1。可見2個鈣處理對WC1和WC9的株體性狀、生產性能性狀和活性氧防御酶系統影響不同，在未施鈣處理下，WC1的株體性狀表現優于WC9，WC9的生產性能性狀表現優于WC1，相對來說WC1具有較強的SOD、CAT活性，而WC9具有較強的POD活性，分析認為WC1和WC9在應對未施鈣處理所產生的反應機制可能會不同。

關鍵詞：花生;鈣;農藝性狀;防御酶系統

中圖分類號： S311;S565.201? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0117-05

花生（Arachis hypogaea L.）是我國主要的油料作物和經濟作物之一，也是海南省的重要油料作物[1]。花生作為豆科一年生草本植物，是調整農業種植業結構的優勢作物[2]，周期短，高度低，適宜農作物及經濟林下間套種。海南省一直有種植花生的傳統習慣，近幾年來由于海南省的花生相對于島外上市早，鮮花生價格較高，大大提高了海南省東方市村民種植的積極性。海南當地的花生種質資源創新利用還處于起步階段，種植的花生多為從島外引進的優良品種，以及農戶自己留存的農家種。海南島是一個典型的熱帶土壤分布區，成土過程中鈣淋失嚴重，土壤交換性鈣含量低，并且鹽基高度不飽和，肥料施入后易遭損失[3-4]，而花生是喜鈣作物，對缺鈣非常敏感[5]，因土壤缺鈣造成花生大幅減產降質的問題尤為突出。因此在生產成本降低和環境保護雙重壓力下篩選耐低鈣花生品種對提高海南花生產量至關重要，而開展不同鈣處理對海南花生種質資源農藝性狀和生理特性的影響獲得的研究結果能夠為選育海南耐低鈣花生新品種奠定基礎。

鈣是植物生長發育過程必需的營養元素之一，參與植物從種子萌發、生長分化、形態建成到開花結果的全過程[6-7]。鈣元素是花生生長需求量較大的營養元素之一，已有一些研究分別通過水培、沙培試驗發現，缺鈣時花生植株矮小，主莖細弱，分枝數、結果數、飽果數少、果小且不飽滿，爛果和空果增多，根系影響尤甚，表現為根系短小，新生根系少，呈黑褐色;而且不同的花生品種間主莖高、干物質量、單株果數、主根長等的降低幅度具有明顯差異[8-13]。Caires等研究認為，大田花生的根密度與土壤鈣含量具有顯著的相關性[14]。大田土壤輕度缺鈣時，花生的總花數減少，莢果發育減退，造成爛果、空果、秕果增多，種仁不飽滿[15]。可見鈣素對維持花生正常的生長發育過程，保證花生高產優質栽培具有不可替代的作用。缺鈣會破環花生的抗氧化保護體系，張海平等通過水培方法研究發現，泉花10號高鈣處理下比低鈣處理下的過氧化氫酶（CAT）活性、過氧化物酶（POD）活性高，而脂質過氧化產物丙二醛（MDA）含量、 O-2 ·? 產生速率、電導率值則低[8]。而增施鈣肥會增加葉片SOD、POD、CAT酶活性和可溶性蛋白的含量[16]。

海南土壤交換性鈣含量低，因缺鈣導致花生產量下降的問題嚴重，而海南花生種質資源豐富，適應性好，但是缺少深入挖掘海南本地的花生種質資源特性的研究，更未見有針對性地研究海南花生種質資源耐土壤低鈣脅迫的相關研究報道。因此，筆者考慮以海南花生種質資源為主要研究材料，以海南低鈣土壤為培養條件，在前期耐低鈣花生種質資源篩選的基礎上，重點對2份表現出潛在耐低鈣花生種質資源進行研究。

以前期篩選出的2份海南花生種質資源為試驗材料，分析不同鈣處理對其株體性狀、生產性能性狀、活性氧防御酶系統的差異性，為進一步選育適宜海南種植的耐低鈣花生種質資源提供理論依據，以及初步解析低鈣環境會造成花生減產降質的原因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為2份在海南省文昌收集的花生種質資源WC1和WC9，株型為直立型，WC1種皮顏色為紅色，WC9種皮顏色為粉紅色。

1.2 試驗方法

盆栽試驗在海南省文昌市中國熱帶農業科學院椰子研究所試驗基地進行，每盆播種2株，供試土壤采自中國熱帶農業科學院椰子研究所，土壤類型為紅壤沙土，具體理化性質為有機質含量為0.67%、堿解氮含量為35.3 mg/kg、有效磷含量為4.2 mg/kg、速效鉀含量為38.7 mg/kg、土壤交換性鈣含量為73.4 mg/kg、土壤交換性鎂含量為7.5 mg/kg，pH值為 4.63。試驗設置2個鈣水平：未施鈣肥和施鈣肥（CaCO3含量為 1 g/kg）2個處理，肥底為每1 kg土施NH4SO4 1.05 g、KH2PO4 0.288 g、MgSO4·7H2O 0.252 g、KCl 0.16 g，開花下針前每1 kg土澆灌Anon微量營養液1 mL，其中施鈣肥處理追施鈣肥（CaCO3含量為0.28 g/kg），所用的肥料均為化學純試劑。

在花生飽果期中期的時候，將全株收獲的花生果在自來水下清洗干凈，按照花生果的成熟度（圖1），將花生果劃分為3個發育時期，分別命名為幼果1期、幼果2期、幼果3期，分別取樣，測定活性氧防御酶系統。幼果1期，也就是花生飽果初期，第1個發育時期，由于種仁很小，連同果皮稱取1 g，后面2個發育時期只稱取果仁1 g，3次重復，保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。酶活性測定均采用購于南京建成生物工程研究所的測試盒，綜合參考酶活性測試盒說明書，按照組織質量（g） ∶ 體積（mL）=1 ∶ 9的比例加入9倍體積的磷酸緩沖溶液（pH值=7.2），冰水浴條件機械勻漿，10 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液用于各項酶活性的測定。花生樣品蛋白質含量的測定方法參考蛋白定量測試盒說明書（貨號：A045-2 考馬斯亮藍法），花生樣品中H2O2含量的測定方法參考過氧化氫（H2O2）測試盒說明書（貨號：A064-1鉬酸顯色法），花生樣品中過氧化氫酶（CAT）活性測定方法參考過氧化氫酶（CAT）測試盒說明書（貨號：A007-1可見光法），花生樣品中谷胱甘肽還原酶（GR）活性的測試方法參考谷胱甘肽還原酶（GR）測試盒說明書（貨號：A062 50T/48樣），花生樣品中過氧化物酶（POD）活性的測試方法參考過氧化物酶（POD）測試盒說明書（貨號：A084-3測植物），花生樣品中總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性的測試方法參考總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒說明書（貨號：A001-1羥胺法）。

2017年3月上旬播種，6月下旬收獲。花生飽果期末期全株收獲，收獲后按照《中國花生品種及其系譜》附錄一“花生種質特征特性術語解釋及觀察記載標準”說明考察主莖高、側枝長、總分枝數、結果枝數、單株飽果數、單株秕果數、芽果數、爛果數、百果質量、出仁率。每盆干果質量和每盆飽果干質量的測定需先在烘箱中烘干后再用天平稱質量考察。

采用Microsoft Excel軟件進行數據的整理與分析，方差分析和相關性分析采用SAS 9.1統計軟件進行。

2 結果與分析

2.1 2個鈣肥處理對2份海南花生種質資源主要株體性狀的影響

從表1可以看出，2個鈣處理對2份海南花生種質資源株體性狀的影響不同，在未施鈣處理下，未施鈣的減少率和減少量為負值或零，主莖高、側枝長、結果枝數均有所增加，WC1的總分枝數沒有增加，而WC9的總分枝數有所增加。WC1在2個鈣處理下，花生的株體性狀指標沒有顯著性差異;而未施鈣處理下WC9的主莖高、總分枝數、結果枝數顯著大于施鈣處理下的主莖高、總分枝數、結果枝數。

2.2 2個鈣肥處理對2份海南花生種質資源主要生產性能性狀的影響

從表2可以看出，2個鈣處理對2份海南花生種質資源生產性能性狀的影響不同，相對于施鈣處理，未施鈣處理下，2份海南花生種質資源的干果質量、飽果干質量、單株飽果數、百果質量、出仁率均減少;秕果數和爛果數均增加;WC1的芽果數減少，WC9的芽果數增加。未施鈣處理下，WC1的干果質量、飽果干質量顯著小于施鈣處理，WC9的干果質量、飽果干質量小于施鈣處理，但是沒有達到顯著水平。在未施鈣處理下，WC9的干果質量、飽果干質量、百果質量和出仁率均大于WC1。相對于施鈣處理，未施鈣處理下，WC1和WC9的含油量都有所減少，減少量分別為5.84%和1.61%，但是均沒有達到顯著水平。

2.3 供試海南花生種質資源在2個鈣處理下主要農藝性狀的相關性

不同鈣肥處理下，2份海南花生種質資源主要農藝性狀見表3，主莖高與側枝長，側枝長與結果枝數、總分枝數與結果枝數、飽果干質量與出仁率、百果質量與出仁率呈顯著相關。總分枝數與單株飽果數呈顯著負相關，單株飽果數與爛果數呈極顯著負相關。

2.4 2個鈣處理對2份海南花生種質資源活性氧防御酶系統的影響

在2個鈣處理下，隨著果實發育的逐漸成熟，相對于幼果1期，其他2個時期下WC1和WC9籽仁中蛋白質含量都表現出急劇上升，WC1和WC9果實發育到幼果2期和幼果3期下籽仁中蛋白質含量都顯著大于幼果1期。施鈣處理下，幼果1期WC9樣品中的蛋白質含量顯著低于WC1，幼果2期WC9樣品中的蛋白質含量顯著高于WC1;未施鈣處理下，果實發育的3個時期中，WC1和WC9的樣品中的蛋白質含量沒有顯著性差異（圖2）。在2個鈣處理下，幼果1期WC1和WC9樣品中H2O2的含量顯著高于幼果2期和幼果3期;在施鈣處理下，幼果1期WC9樣品中H2O2的含量顯著高于WC1，其余條件下，WC1和WC9樣品中H2O2的含量沒有顯著性差異（圖3）。在2個鈣處理下，隨著果實發育的逐漸成熟，WC1和WC9樣品中CAT活性逐漸增強，在施鈣處理下，幼果2期和幼果3期下WC9樣品中CAT活性顯著低于WC1;在未施鈣處理下，WC9樣品中CAT活性低于WC1，但是只有在幼果2期時才達到顯著水平（圖4）。在施鈣處理下，幼果1期WC9果實中GR活性顯著大于WC1。幼果1期WC9樣品中GR活性顯著高于其他2個時期，WC1樣品中GR活性均沒有顯著性差異。在未施鈣處理下，WC1幼果1期樣品中GR活性顯著高于其他2個時期（圖5）。在施鈣處理下，幼果1期WC9樣品中SOD活性顯著高于WC1，幼果2期和幼果3期WC1和WC9這2個樣品中SOD活性沒有顯著性差異;在未施鈣處理下，幼果2期WC1樣品中SOD活性顯著高于WC9，幼果1期和幼果2期沒有顯著性差異（圖6）。在2個鈣處理下，WC1和WC9樣品中POD活性隨著果實發育的成熟逐漸呈下降趨勢，在施鈣處理下，幼果1期WC9樣品中的POD活性顯著高于WC1，在未施鈣處理下，WC1樣品中POD活性顯著高于WC9，然而幼果2期WC9樣品中POD活性顯著高于WC1（圖7）。

3 討論與結論

花生是喜鈣作物，鈣素對維持花生正常的生長發育過程、保證花生高產優質栽培具有不可替代的作用。張君誠等通過在平潭典型缺鈣大田種植泉花10號研究發現，因土壤鈣含量不足使花生莢果空秕和種子發育受阻而導致產量降低的現象很明顯[17];隨后采用套盆分層組合水培方法，分析泉花10號在不同鈣水平處理下花生相關生物學性狀和結果情況 發現高低鈣水平下，植物營養體差異明顯，飽果率差異顯著。套盆分層組合水培方法雖然總體結果基本正常，但仍然存在結莢總數比同濃度的大田少，部分莢果異常現象[18]。李忠等通過砂培方法，在高鈣（鈣含量200 mg/L）和低鈣（鈣含量 40 mg/L）處理條件下對12個不同基因型花生品種進行研究，發現不同花生品種耐低鈣能力不同，認為花生莢果產量、植株地上部干物質量和根干質量可以作為鑒別砂培條件下花生品種耐低鈣能力的有效指標[10]。楊運萍采用田間試驗對廣東省4個主栽的花生品種在Ca0、Ca1、Ca2和Ca3 4個鈣水平下花生植株地上部含鈣量和鈣積累量、種子含鈣量、生理性狀、農藝性狀和產量構成因素的差異井進行研究，發現不同花生品種對低鈣的適應性具有差異性，百仁質量對4個花生品種鈣效率的影響最大[19]。趙秀芬等采用砂培桶栽的方式對10個主栽花生品種的研究發現，它們莢果產量和籽粒產量均表現為正常供鈣顯著高于低鈣脅迫，而植株生物量恰好相反，表現為低鈣處理顯著高于正常供鈣處理[20]。本研究通過土壤盆栽的方法研究發現，2個鈣處理對WC1和WC9的株體性狀影響不同，WC9的主莖高、總分枝數、結果枝數表現為未施鈣處理顯著大于施鈣處理。2個鈣處理下2份海南花生種質資源的生產性能性狀差異較大，相對于施鈣處理，未施鈣處理下，2份海南花生種質資源中有助于提高生產性能的干果質量、飽果干質量、單株飽果數、百果質量、出仁率均減少;而有助于降低生產性的秕果數和爛果數均增加;但是WC1和WC9在施鈣和未施鈣處理下表現仍不相同。在未施鈣處理下，WC9的干果質量、飽果干質量、百果質量和出仁率均大于WC1。花生施用鈣肥可以提高籽仁脂肪含量[16]，本研究發現，相對于未施鈣肥，在施鈣肥處理下，2份海南花生種質資源的含油量均有所增加。

唐兆秀等采用凱氏定氮法研究發現，花生籽仁蛋白質含量隨生育進程，在開花40～50 d急劇增加，后平緩上升。花生蛋白質合成積累一直伴隨花生籽仁發育的全過程。南方珍珠豆型不同基因型花生可溶性蛋白質相對含量存在差異。蛋白質合成和積累速度不同，可溶性總蛋白質相對濃度的峰值出現在70～80 d[21]。但是唐兆秀等的研究結果中蛋白質積累曲線和峰值出現時間與戴良香等研究的結果[22]不同，其認為是南北方的氣候特點和基因型差異所致。本研究采用Bradford法研究發現，花生在幼果1期時的蛋白質含量最低，隨后總體呈一個逐漸增加的趨勢，與花生籽仁蛋白質含量隨生育進程逐漸增加的趨勢相同。

缺鈣壞境也是一種逆境壞境，許多逆境都會導致過量的ROS產生，而對逆境耐性強的植物往往其氧化系統也較強，包括抗氧化的化合物含量和抗氧化酶的活性[23]。 O-2 ·? 產生于氧還原的第1步，隨后能快速地被SOD轉化為H2O2，過量的O-2 ·? 會轉化為其他的ROS，如羥基自由基或過羥基自由基等，從而導致膜脂過氧化。SOD把O-2 ·? 轉化為H2O2后，高濃度的H2O2仍會引起氧化脅迫損傷。在植物中CAT、APX、GPX被認為是清除H2O2最普遍的酶。GR參與抗壞血酸-谷胱甘肽的循環，在抗氧化系統中起著重要作用[24]。2個鈣處理下，隨著果實發育的逐漸成熟，WC1和WC9的H2O2含量逐漸降低，而WC1和WC9樣品中CAT活性逐漸增強，由于CAT是清除H2O2最普遍的酶，隨著果實發育的逐漸成熟，伴隨著CAT活性的增加，清除了樣品中H2O2含量，使得樣品中H2O2含量下降。在未施鈣處理下，WC9樣品中CAT活性低于WC1，并且在幼果2期達到顯著水平，而WC9樣品中H2O2含量并沒有比WC1高，也沒有達到顯著水平。未施鈣肥處理下，在幼果2期WC1樣品中SOD活性顯著高于WC9;在幼果1期和幼果2期未施鈣肥處理下WC1樣品中的SOD活性顯著高于施鈣肥處理。產生此現象的原因可能是，在不施鈣肥處理下，果實2時期下，WC1相對于WC9在逆境環境下產生更多O-2 ·? ，因此也需要更強酶活性的SOD將O-2 ·? 轉化為H2O2，同時也有強酶活性的CAT清除了H2O2，最終使得WC1和WC9的H2O2含量沒有顯著性差異。在施鈣處理下，幼果1期WC9的GR活性顯著大于WC1。POD也是活性氧防御酶系統中重要的一員，能夠避免活性氧的毒害作用。在2個鈣處理下，隨著果實發育的逐漸成熟，樣品中POD活性呈一個逐漸下降趨勢，幼果2期下，未施鈣肥處理下，WC9的POD活性顯著高于WC1;未施鈣肥處理下的WC9樣品中POD活性顯著高于施鈣肥處理。

2個鈣處理對WC1和WC9的株體性狀、生產性能性狀和活性氧防御酶系統影響不同，在未施鈣處理下，WC1的株體性狀優于WC9，WC9的生產性能性狀優于WC1，在應對未施鈣處理的逆境環境，WC1和WC9表現出的活性氧防御酶系統不同，相對來說WC1具有較強的SOD和CAT活性，而WC9具有較強的POD活性，整體來說WC1和WC9在應對未施鈣處理所產生的反應不同，其更深層次的不同的耐低鈣機制還需進一步研究。

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