葉疫病菌侵染芒果后葉片細胞壁降解酶活性測定

楊鄭州 黃柳芳 謝曉娜 蘇仕林

摘要：為明確葉疫病病菌侵染芒果后細胞壁降解酶活性的變化，以臺農芒果葉作為試驗材料，通過體外培養的方法分離得到芒果葉疫病菌，將其接種于離體的芒果幼葉，利用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法和紫外分光光度計法檢測病原菌侵染過程中細胞壁降解酶活性的變化。結果表明，在細胞壁降解酶中，β-葡萄糖苷酶活性最高，羧甲基纖維素酶（Cx）活性與多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性次之，聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）活性最低;纖維素酶在病原菌侵染初期最早分泌并起作用，并且纖維素酶比果膠酶對芒果葉片的致病作用明顯。

關鍵詞：芒果;葉疫病;細胞壁降解酶;活性測定;3，5-二硝基水楊酸法;紫外分光光度計法;減少產量損失

中圖分類號： S436.67+9? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0138-03

芒果被稱為熱帶水果之王。在我國，芒果主要種植在東南部的云南和南部的貴州與廣西地區[1-2]，芒果葉疫病別稱為交鏈孢霉葉枯病，主要危害樹冠下老葉，在一些實生苗與嫩葉上發病率高，其生長溫度條件充足，在雨水充足時期發病率高，隨著雨水的降臨，葉疫病的菌絲可侵染嫩葉及抵抗力弱的老葉，具有一定的傳染性。嚴重時可導致葉片大量枯死，影響植株生長。植物細胞壁是植物健康的保障，病原菌通過入侵植物細胞壁，分泌細胞壁降解酶使植物受到侵染，從而導致病害的發生。細胞壁降解酶是病原菌侵染寄主組織的主要致病因子之一[3]，本試驗致力于研究植物細胞壁降解酶的種類與其在致病過程中所起到的作用，為進一步研究芒果與葉疫病菌的互作機制及減少芒果果產量損失提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用材料為臺農芒果，摘取病葉為廣西壯族自治區百色市右江區本地臺農芒果樹上的老葉，分離純化得到芒果葉疫病病菌，針刺法接種于離體臺農芒果幼葉，臺農幼苗于2016年9月至2017年1月種植于百色學院實驗樓前，待葉長至8張時，取不同植株同一位置的幼葉，以針刺后不接種菌絲的葉片為空白對照，放于28 ℃條件下倒置培養，分別于接種后2、4、6、8、10、12 d取樣，而后樣品保存于-20 ℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 摘取疑似芒果葉疫病的臺農芒果葉片，于實驗室用流水洗凈，表面消毒后，使用0.1%氯化汞消毒1.5 min，75%乙醇消毒30 s，蒸餾水潤洗3次每次 1 min;所用器皿均已高壓滅菌，利用剪刀裁取病健交界處 0.5 mm2 左右葉片，放入馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基中，28 ℃倒置培養。通過點接的方法分離純化致病菌。

1.2.2 病原菌反侵染 根據柯赫氏法則將已純化的菌絲分別接種至同一品種、同一長勢的百色市本地健康無病害的實生苗上。摘取與葉疫病原癥狀一致的葉片，重新進行葉片中致病菌的分離，觀察2種病菌是否為同一種。

1.2.3 酶液的提取 稱取葉片1 g，放入研缽中，進行冰浴研磨，1 g樣品中加入5 mL 1 mol/L NaCl提取液（20 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH值7.4），然后倒入10 mL離心管中，4 ℃，10 000 r/min離心15 min，上清液即為酶的粗提液，于 4 ℃ 保存。

1.2.4 羧甲基纖維素酶（Cx）活性測定 量取1 mL粗酶液，加入1 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，再加入1 mL底物（底物配制：稱取0.1 g羧甲基纖維素鈉溶于10 mL pH值為5.0的 50 mmol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中），在50 ℃下酶解 30 min，加入1 mL 3，5-二硝基水楊酸（DNS），沸水浴 10 min，取出后經流水冷卻，在540 nm處測定吸光度。

1.2.5 β-葡萄糖苷酶活性測定 參照“1.2.4”步驟，底物配制：稱取0.1 g水楊苷溶于10 mL pH值為5.0的 50 mmol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

1.2.6 多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性測定 參照“1.2.4”步驟，底物配制：稱取0.1 g多聚半乳糖醛酸溶于10 mL pH值為5.0的50 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

1.2.7 聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）活性測定 參照“124”步驟，底物配制：稱取0.1 g果膠溶于10 mL pH值為50的 50 mmol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

Cx、β-葡萄糖苷酶、PG與PMG的酶活性單位為50 ℃下1 min催化1 μg還原糖所需酶量，根據D-半乳糖標準曲線計算生成的還原糖，還原糖采用DNS比色法測定。

酶蛋白濃度測定按照Bradford的方法[4]進行，用考馬斯亮藍G-250顯色，在595 nm處比色測定，用小牛血清蛋白（BSA）作標準曲線y=0.362 2x+0.078 1，r2=0.998 4。

2 結果與分析

2.1 芒果葉疫病病原菌形態結構

由圖1、圖2可知，此次分離得到的病原菌即為芒果葉疫病病原菌細極鏈格[Alternariatenuissima（Fr.）Wiltsh]，屬半知菌類真菌。濕度大時病斑上出現灰色霉狀物，即病菌分生孢子梗和分生孢子。梗單生或2～3根叢生，褐色，偶爾出現1個膝狀曲折，分生孢子倒棍棒形，單生或2～4個串生，孢身褐色，大小為（18.8～31.3） μm×（8.0～12.5） μm，具橫隔膜3～6個，縱隔膜1～3個，喙變化較大，色略淺，長3.8～11.3 μm。

芒果葉疫病病原菌前期生長較為緩慢，在生長至第3天后生長態勢急劇上升，第7天可達到生長頂峰，第8天開始有孢子產生。病原菌菌絲生長形態細密、綿軟，菌絲向上生長約0.5 cm，形成內凹外凸的形狀，菌絲以散射狀形勢向外擴散，孢子以接種中心為圓心向培養基邊緣部分擴散，在孢子生成過程中孢子可在培養皿中形成同心圓。

2.2 Cx活性測定

由圖3可知，試驗處理組酶活性在接種后4 d達到高峰，此時是對照組的1.365倍，隨后酶活性開始下降，在12 d又達到第3次酶活性高峰，為對照組的3.938倍。對照組酶活性在培養過程中隨著時間的推移整體逐漸降低。

2.3 β-葡萄糖苷酶活性變化

由圖4可知，β-葡萄糖苷酶在接種后2 d達到酶活性高峰，是對照組酶活性的1.243倍，試驗處理組在接種后10 d達到第2次酶活性高峰，是對照組酶活性的2.807倍。試驗組β-葡萄糖苷酶活性在10 d后開始急劇下降，對照組 β- 葡萄糖苷酶活性隨著時間的增加而下降。

2.4 PG活性的變化

由圖5可知，接種后2 d試驗處理組PG活性低于對照組PG活性，此時試驗組葉片中PG活性受到抑制，接種后6 d PG活性逐漸上升，接種后8 d PG活性達到峰值，是對照組的2.596倍。對照組PG活性隨著接種時間的增加整體逐漸減小。

2.5 PMG活性變化

由圖6可知，試驗處理組PMG活性在接種后4～6 d內無明顯變化，接種8 d后受到明顯抑制，接種10 d后活性達到高峰，是對照組PMG活性的1.568倍，對照組PMG接種后先急劇下降后達到平衡。

2.6 酶活醒比較

由圖7可知，芒果感染葉疫病病菌后β-葡萄糖苷酶活性最高，Cx、PG活性次之，PMG活性最低。

3 結論與討論

本試驗探討了細胞壁降解酶的致病性作用，試驗從芒果葉疫病病原菌的提取到病原菌的致病機制研究，期間做了多次預試驗與試驗分析，并從中挑選出最佳的試驗方案。本研究所用的芒果病葉最佳的消毒方法為流水沖洗5 min，氯化汞消毒溶液消毒1.5 min，75%乙醇消毒30 s，最后得出的芒果病葉細菌感染率最低。芒果葉疫病具有感染性，可通過空氣中的水與風傳播，孢子可隨風依附在樹葉上，遇水后生長，因此芒果葉疫病在雨季多發。病原菌侵染過程中相關酶的活性出現高低起伏變化可能是活體外葉片的自身免疫作用，β-葡萄糖苷酶在接種后2 d出現酶活性高峰，Cx和PG在接種后 8 d 出現酶活性高峰，這與前人研究結果一致。李敏等在研究可可球二孢產細胞壁降解酶在侵染芒果果實過程中的作用時發現可可球二孢在離體培養條件下或接種芒果果實后均可產生PG、PMG、多聚半乳糖醛酸反式消除酶（PGTE）、果膠甲基反式消除酶（PMTE）及Cx，其中PG、PMG和Cx活性較高，PGTE和PMTE活性極低[5]。在大量分泌的3種細胞壁降解酶中，PG和Cx活性高峰出現較早，PMG活性高峰出現較遲。芒果葉疫病病原菌侵染過程中，β-葡萄糖苷酶活性最高，Cx、PG活性次之，PMG活性最低。王麒然等研究花生品種對葉腐病的抗性鑒定時發現，花生葉腐病菌能產生果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶、漆酶等細胞壁降解酶，無論活體外養還是接種植株體內都表現為果膠酶活性最高，其次是漆酶和木聚糖酶，活性最弱的是纖維素酶[6]。高增貴等研究發現，玉米莖腐病菌在活體內和活體外都能分泌細胞壁降解酶，其產生的果膠酶、纖維素酶等都對玉米胚根有明顯的浸解作用，并且隨著酶液濃度的升高浸解能力也逐漸增強，表明果膠酶、纖維素酶等細胞壁降解酶是玉米莖腐病菌的重要致病因子[7]。Lalaoui等研究發現，木聚糖酶在菜豆褐斑病菌（Phyllosticta phaseolina）致病中起重要作用[8]。陳曉林等研究發現，腐爛病菌在寄主體內產生細胞壁降解酶的活性變化規律不同，PMG和木聚糖酶在接種后最先被檢測到活性顯著升高，PMG活性于接種后第13天達到高峰，隨后活性降低，而木聚糖酶和其他3種酶活性則隨接種天數的增加活性不斷增強;5種細胞壁降解酶中，Cx最大酶活性最低，而木聚糖酶活性最高，是其他酶最大酶活性的1.74～7.44倍[9]。因此，細胞壁降解酶是一些植物病原菌的重要致病因子。Kang等研究發現，引起小麥根腐的禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）分泌果膠酶活性高的菌株致病性相對強，并且果膠甲基半乳糖醛酸酶（PME）和PG不僅比其他酶活性高，而且它們之間還存在協同作用，突顯果膠酶是該病菌的主要致病因子[10-11]。張大智等探討了芒果細菌性角斑病在發病過程中產生細胞壁降解酶的種類及其在致病過程中的作用，結果發現細胞壁降解酶在病原菌的入侵和致病過程中起重要作用[12]。果膠酶在病原菌侵染初期最早分泌并起作用，纖維素酶主要降解次生壁，致病作用發生在后期，并且果膠酶比纖維素酶對芒果葉片的致病作用明顯[12]。但本研究發現起主要致病作用的是纖維素酶，纖維素酶活性先達到峰值，之后果膠酶活性才升高，這可能是因為致病菌的不同而導致了二者分泌先后順序的差異。本研究通過對芒果活體接種葉疫病病菌產生的細胞壁降解酶進行活性分析，也表明β-葡萄糖苷酶活性最高，Cx、PG、PMG活性與病菌侵染芒果及葉疫病發生密切相關，進一步明確了細胞壁降解酶在一些病菌致病中起著重要作用，是主要的致病因子的觀點。

本研究表明，病原菌侵染宿主時，起主要作用的細胞壁降解酶是β-葡萄糖苷酶，羧甲基纖維素酶二者都屬于纖維素酶，纖維素酶起作用不斷分解植物的細胞壁，降低機體免疫力;而在接種之后，PG與PMG開始活躍，二者都屬于果膠酶，致病菌開始生長;也即是纖維素酶在病原菌侵染初期最早分泌并起作用，并且纖維素酶比果膠酶對芒果葉片的致病作用明顯。

參考文獻：

[1]周榮光，楊兆祥，王 金，等. 芒果皮提取物的體外清除自由基作用研究[J]. 云南中醫中藥雜志，2012，33（2）：50-52.

[2]劉榮光，歐古經，謝燕萍，等. 廣西杧果生產與科研考察[J]. 廣西農業科學，1995（5）：213-217.

[3]Patil R，PathakV. Effect of fruit ripeness in relation to synthesis and activity of cell wall degrading enzymes of mango rot pathogens[J]. Indian J Mycol Plant Pathol，1994，24（2）：156-157.

[4]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities protein vtilizing the principle of protein-dye binding [J]. Analytical Biochemitry，1976，72（1/2）：248-254.

[5]李 敏，高兆銀，胡美姣，等. 可可球二孢（Botryodiplodia theobromae）細胞壁降解酶對杧果果實致病作用[J]. 果樹學報，2011，28（6）：1054-1058.

[6]王麒然，吳菊香，張茹琴，等. 花生葉腐病菌分泌的細胞壁降解酶活性測定及致病性分析[J]. 植物生理學報，2016，52（3）：269-276.

[7]高增貴，陳 捷，高洪敏，等. 玉米莖腐病菌產生的細胞壁降解酶種類及其活性分析[J]. 植物病理學報，2000，30（2）：148-152.

[8]Lalaoui F，Halama P，Dumortier V，et al. Cell wall-degrading enzymes produced in vitro by isolates of Phaeosphaeria nodorum differing in aggressiveness[J]. Plant Pathol，2000，49（6）：727-733.

[9]陳曉林，牛程旺，李保華，等. 蘋果樹腐爛病菌產生細胞壁降解酶的種類及其活性分析[J]. 華北農學報，2012，27（2）：207-212.

[10]Kang Z，Buchenauer H. Ultrastructural and cytochemical studies on cellulose，xylan and pectin degradation in wheat spikes infected by Fusarium culmorum[J]. J Phytopathol，2000，148（5）：263-275.

[11]Thorsten H . Plant cell wall integrity maintenance as an essential component of biotic stress response mechanisms[J]. Frontiers in Plant Science，2012，3：1-5.

[12]張大智，詹儒林，柳 鳳，等. 杧果細菌性角斑病菌細胞壁降解酶的致病作用[J]. 果樹學報，2016，33（5）：585-593.