抗根腫病大白菜小孢子培養及分子鑒定

陳麗瀟 王躍華 劉鑫 惠麥俠 趙利民 趙小平

摘要：以10個抗根腫病大白菜品種為試材，研究影響小孢子出胚的因素，并對DH植株進行根腫抗性分子檢測。結果表明，基因型是影響出胚的最主要因素，參試的10個品種中僅有3個出胚，其中15CR82出胚率最高，為 3.36個/蕾。基因型還決定了胚狀體的類型及大小，胚的大小對于轉綠成苗率有一定影響。一般直徑大于2 mm的胚狀體容易轉綠成苗。用根腫抗性基因CRa的特異分子標記CRaEXON4-3篩選DH群體，獲得27個攜帶抗性基因植株。

關鍵詞：大白菜;抗根腫病;游離小孢子培養

中圖分類號： S634.103? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0141-03

大白菜（Brassica campestris ssp. pekinensis）屬于十字花科蕓薹屬蕓薹種大白菜亞種，是一種起源于我國的重要蔬菜作物。根腫病是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woron）侵染引起的一種世界性病害[1-2]，主要感病植物有大白菜、青菜、芥菜等十字花科蔬菜[3]。根腫病病菌被歸為原生界根腫菌門，其通過侵染十字花科植物根毛導致根部薄壁細胞增生而形成腫瘤[4]，從而影響植物吸水功能[5]，使地上部分生長遲緩、缺水萎蔫[6]。該病最初于1737年被發現在地中海西岸（英國）和歐洲南部（前蘇聯列寧格勒），由于該病傳染力強，傳播途徑多，感病植物根部釋放的休眠孢子在土壤中存活可達10年[7]，隨后在世界各地的十字花科蔬菜種植區域蔓延擴散。又由于發病初期蔬菜地上部分的癥狀不明顯，不易被發現，使得發病地區減產嚴重，根腫病又有“根癌”之稱，已成為一種世界性難題。

近年來，根腫病的防治方法主要有農業防治、生物防治、化學防治及抗病育種等。而從環境保護、成本、管理難易程度等方面考慮，選用抗病品種是目前防治根腫病的最佳方案[8]。游離小孢子培養（isolated microspore culture，簡稱IMC）技術是由Nitsch在進行花藥培養的同時創建和發展的，1982年德國的Lichter率先在甘藍型油菜上成功地進行了游離小孢子培養，并發現小孢子胚胎及其再生植株的產量遠高于花藥培養[9]，這引起了育種工作者的濃厚興趣，此后小孢子培養技術在農作物，尤其是蕓薹屬蔬菜作物中得到了迅速發展。利用游離小孢子培養技術，可以快速純化含有抗病基因的植株，并從大量的抗病雙單倍體（doubled haploid，簡稱DH）群體中，尋找具有優良生物性狀的植株作為親本進行下一步的育種工作。本研究以10份市售的抗根腫病大白菜品種為材料，篩選易出胚的基因型材料，并利用根腫抗性基因CRa分子標記對種質進行篩選，以期為大白菜抗根腫病新品種的選育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試抗根腫病大白菜材料為15CR37、15CR38、15CR53、15CR82、15CR104、15CR121、15CR122、15CR128、15CR132、15CR136，均由西北農林科技大學十字花科蔬菜研究室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 試材準備 材料于2016年10月15日播種于陜西省油菜雜交中心大田，自然條件下春化，常規田間管理，于2017年3月26日始花期至4月22日終花期取材培養。

1.2.2 游離小孢子培養 在大白菜初花期和盛花期，于每天08：00—11：30摘取健壯花序上未開的花蕾，花蕾長度為 2.0～3.5 mm。用鑷子挑開花蕾，小心擠出花粉，利用顯微鏡挑選細胞為圓球形，小孢子發育處于單核靠邊期，且細胞有一定透光度的花蕾。如細胞為三角形及其他不規則形狀，并且細胞顏色極淺則是時期過早，花蕾過小;如細胞成橢圓形且中部較暗透光較差，則是花粉已成熟，花蕾過大。挑選好的花蕾先用75%乙醇消毒1 min，再用0.1%氯化汞消毒15 min，無菌水沖洗3遍。加入6～10 mL的B5洗滌培養基（含13%蔗糖），用玻璃棒碾壓花蕾使花蕾破碎，小孢子游離于B5培養基中，用50 μm孔徑的尼龍網過濾，收集濾液于離心管中。1 200 r/min 離心5 min，棄去上清液后加入B5培養基懸浮花粉，再次離心，重復3次后棄去上清液，加入含有100 mg/L秋水仙堿的NLN-13液體培養基（含13%蔗糖）懸浮小孢子。將小孢子懸浮液稀釋后分裝于4個60 mm的培養皿中，每個皿的培養基體積約為5 mL，用封口膜封口，放于32 ℃培養箱中，暗培養48 h。取出未污染的樣品，將懸浮液加入離心管中，1 200 r/min離心5 min，棄去上清，加入10 mL NLN-10液體培養基（含10%蔗糖）懸浮花粉，將懸浮液加入到90 mm培養皿中，封口后放入25 ℃條件下進行暗培養。經過10～15 d出現肉眼可見的白色細小顆粒，將出現白色細小顆粒的培養皿放到室溫下的搖床上避光振蕩培養，15 d后統計出胚率及胚胎類型。胚狀體的直徑小于1 mm時，不統計在內。

1.2.3 基因型對小孢子胚胎發生的影響 10份大白菜材料進行游離小孢子培養，暗培養10 d、振蕩培養15 d后統計出胚率及胚胎類型。每個品種各挑取100個花蕾分裝于4個培養皿中，每個培養皿25個花蕾。

1.2.4 胚狀體種類對轉綠成苗的影響 所有胚狀體均統一轉入MS固體培養基（MS+0.2 mg/L KT+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂），放到光—暗周期為12 h—12 h，光照度為 1 500 lx，溫度為24 ℃的培養間，2周后分別統計其轉綠率。

1.2.5 DH群體分子篩選 所有獲得的小孢子植株，剪取少量葉片組織，用簡化CTAB法提取DNA，用筆者所在課題組開發的根腫病抗性基因CRa特異分子標記進行篩選，統計條帶類型。

2 結果與分析

2.1 基因型對大白菜游離小孢子出胚率的影響

不同基因型的抗根腫病大白菜小孢子的胚胎發生能力差異很大。由表1可知，10個供試材料有3個得到了胚狀體，成功率為30%。其中15CR82出胚率最高，為3.36個/蕾，其次為15CR136，出胚率為1.32個/蕾，15CR53的出胚率最低，為0.84個/蕾。

2.2 基因型對大白菜游離小孢子胚狀體類型的影響

胚狀體的形狀和大小與基因型也存在很密切的關聯。材料15CR82的胚狀體主要為子葉型胚與球形胚，且數量多體積小，直徑一般為0.5～3.0 mm，直徑小于1 mm的胚數量較多。材料15CR53和15CR136的胚狀體則主要為子葉型胚與畸形胚，且體積較大，直徑一般為1～8 mm（圖1）。

2.3 胚狀體類型對大白菜胚狀體轉綠的影響

由表2可知，當胚狀體的體積達到一定大小時，有助于其轉綠。子葉胚相對于其他類型胚狀體更容易成苗，子葉胚寬度小于2 mm時 一般很難轉綠 也就無法成苗。15CR53和15CR136的子葉胚較大，容易轉綠，其轉綠率分別為67.3%、69.7%，15CR82的胚狀體數量最多，體積小，大部分直接白化、褐化，轉綠的胚狀體數量較少，轉綠率極低，只有19.8%。

2.4 DH群體分子鑒定

由圖2可知，對獲得的40個DH植株進行CRa基因的分子檢測，植株間表現多態性，擴增條帶大小為705 bp的有27株，含抗性基因CRa，表現為純合抗病，擴增條帶大小為 413 bp 的有9株，不含抗性基因CRa，表現為感病。由結果可知，純合抗病植株與感病植株比為3 ∶ 1。4、27、28、29號樣品條帶大小為500 bp，與其他材料的大小不一致，表現為材料間多態性。

3 結論與討論

基因型對游離小孢子培養的胚狀體發生來說是最關鍵的因素之一，Bhatia等利用30個印度花椰菜品種進行研究，其中13個品種得到了胚狀體[10]。盧松等用3個微型結球白菜品種進行試驗，有1個品種得到了胚狀體[11]。本試驗以10個抗根腫病大白菜品種進行游離小孢子培養，其中有3個品種得到了胚狀體。15CR82的出胚率最高（3.36個/蕾），而材料15CR53的出胚率相對較低（0.84個/蕾）。胚狀體的發生不僅受到基因型的影響，而且還受一些外部條件的影響，同一品種胚狀體的發生具有很大的偶然性，可能某一天出胚率極

高，也可能沒有發生胚狀體。在這個未知條件還沒有解決之前，由于花期時長有限，試驗中盡量保證每天有足夠的花蕾是獲得較多DH植株的一個簡單直接的方式。

除了基因型對小孢子培養的影響外，如何高效利用已經形成的胚狀體是一個亟待解決的問題。本試驗發現，胚狀體的大小對于轉綠率的影響比較大，子葉胚寬度小于2 mm時，一般很難轉綠，推測由于出胚率較高的品種、有限的空間及培養基限制了胚狀體生長空間及獲得較多營養物質。筆者嘗試將較大的胚狀體轉出后，換成新的NLN-10培養基繼續避光振蕩培養，結果顯示該方法可促進胚狀體的生長，提高轉綠率。歸因于增加胚狀體生存空間及可用營養物質，同時置換掉培養基中胚狀體產生的一些有害代謝產物。同一品種在不同時期的出胚率也不一樣，說明外在環境條件對胚狀體發生也會產生一定影響，探究利于出胚的環境條件，也是一個可以有效提高易出胚品種出胚數的方法。

利用抗根腫病基因特異分子標記可以快速檢測大白菜材料含有的抗病基因，本研究利用CRa特異分子標記檢測獲得的40個DH植株，有27個攜帶抗性基因CRa，純合抗病植株與感病植株比為3 ∶ 1。所用供試母株材料為雜合植株，根據孟德爾遺傳定律中的分離定律，預測試驗結果純合抗病植株與純合感病植株比為1 ∶ 1，與本次試驗結果相差較大。由于成苗過程中胚狀體有大量損耗，所以無法判斷是含有抗根腫病Cra基因的花粉更容易形成胚狀體，還是含有抗病基因的胚狀體更容易成苗。在后續試驗中，可以通過拓寬供試材料基因型，增加出胚率、提高成苗率等有效方法來獲取更多抗根腫病純合種質資源，進而應用于抗根腫病育種實踐當中。

參考文獻：

[1]田雅琳. 十字花科根腫病研究現狀及未來趨勢[J]. 天津農業科學，2015，21（4）：123-126.

[2]索 歡，陳龍正，徐 海，等. 十字花科根腫病研究進展[J]. 安徽農業科學，2015，43（14）：115-117，126.

[3]張 紅，張 斌，聞鳳英，等. 大白菜根腫病的遺傳規律及抗病基因定位研究[J]. 華北農學報，2017，32（4）：60-66.

[4]原玉香，趙艷艷，魏小春，等. 河南省大白菜根腫病菌生理小種鑒定[J]. 河南農業科學，2017，46（7）：71-76.

[5]楊 征. 大白菜抗根腫病品種鑒定與抗病基因定位研究[D]. 青島：青島農業大學，2015.

[6]黃元貴. 十字花科作物根腫病綜合防治技術[J]. 現代農業科技，2017（3）：111-111.

[7]Kageyama K，Asano T. Life cycle of Plasmodiophora brassicae[J]. Journal of Plant Growth Regulation，2009，28（3）：203-211.

[8]羅延青，李勁峰，俎 峰，等. 蕓薹屬作物根腫病抗性遺傳研究進展[J]. 安徽農業科學，2011，39（31）：19162-19163.

[9]Lichter R. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus[J]. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie，1982，105（5）：427-434.

[10]Bhatia R，Dey S，Sood S，et al. Efficient microspore embryogenesis in cauliflower （Brassica oleracea var. botrytis L.） for development of plants with different ploidy level and their use in breeding programme[J]. Scientia Horticulturae，2017，216：83-92.

[11]盧 松，陶 蓮，吳康云，等. 微型結球白菜小孢子的培養及植株再生[J]. 貴州農業科學，2015，43（8）：30-33.