CYP2C9和VKORC1基因多態性對華法林劑量的影響研究

梁紅梅 鄔銀偉 王艷群

【摘要】 目的 探究細胞色素氧化酶2C9（CYP2C9）基因和維生素K環氧化物還原酶復合物1基因（VKORC1）-1639 G/A多態性對華法林初始抗凝劑量的影響。方法 200例使用華法林患者， 觀察患者使用華法林5～7 d后凝血酶原時間（PT）和國際標準化比值（INR）， 記錄患者服用華法林初次達標天數、總用量和平均每日用量， 同時測定患者CYP2C9位點基因型（*1、*2、*3）和VKORC1-1639位點基因型（AA、AG、GG）。結果 CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG基因型患者初次達標天數分別為（14.47±1.52）、（9.77±0.91）d， 總用量分別為（115.13±11.47）、（56.31±5.49）mg， 平均每日用量分別為（5.22±0.53）、（4.36±0.44）mg， CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者初次達標天數分別為（9.24±0.94）、（5.37±0.52）d， 總用量分別為（52.37±5.14）、（15.56±1.42）mg， 平均每日用量分別為（3.02±0.35）、（3.21±0.36）mg;CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG基因型患者初次達標天數均長于CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者， 總用量及平均每日用量均大于CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者， 差異有統計學意義（P<0.05）。結論 對于服用華法林的患者， 對CYP2C9、VKORC1-1639基因多態性的測定具有重要指導價值， 能幫助臨床實施個體化用藥， 值得臨床應用與推廣。

【關鍵詞】 華法林;細胞色素氧化酶2C9基因;維生素K環氧化物還原酶復合物1基因;基因多態性

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.19.110

【Abstract】 Objective? ?To investigate the effect of cytochrome oxidase 2C9 （CYP2C9） gene and vitamin K epoxide reductase complex 1 （VKORC1） - 1639 G/A polymorphism on the initial anticoagulant dose of warfarin. Methods? ?There were 200 patients treated with warfarin. Their prothrombin time （PT） and international normalized ratio （INR） were observed after 5～7 d of warfarin， and first standard-reaching day of warfarin administration， total dosage and daily dosage of warfarin were recorded. The genotypes of CYP2C9 （* 1， * 2， * 3） and VKORC1-1639 （AA， AG， GG） were also determined at the same time. Results? ?Patients with CYP2C9*1 and CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG genotypes had first standard-reaching day respectively as （14.47±1.52）， （9.77±0.91）d， total dosage respectively as （115.13±11.47）， （56.31±5.49）mg， and mean daily dosage respectively as （5.22±0.53）， （4.36±0.44）mg. Patients with CYP2C9*1 and CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA genotypes had first standard-reaching day respectively as （9.24±0.94）、（5.37±0.52）d，? total dosage respectively as （52.37±5.14）， （15.56±1.42）mg， and mean daily dosage respectively as （3.02±0.35）， （3.21±0.36）mg. Patients with CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG genotypes had longer first standard-reaching day than patients with CYP2C9*1 and CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA genotypes， and more total dosage and mean daily dosage than patients with CYP2C9*1 and CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA genotypes. Their difference was statistically significant （P<0.05）. . Conclusion? ?For the patients taking warfarin， it has important guiding value for the determination of CYP2C9 and VKORC1-1639 gene polymorphism， and can help to implement individualized drug use in clinic. It is worthy of clinical application and promotion.

【Key words】 Warfarin; Cytochrome oxidase 2C9 gene; Vitamin K epoxide reductase complex 1 gene; Gene polymorphisms

華法林作為一種香豆素衍生物， 在血栓性疾病的抗凝治療中發揮著重要作用， 是目前臨床上應用最廣泛的口服抗凝藥物。其主要用于肺栓塞、深靜脈血栓等栓塞性疾病治療以及人工心臟瓣膜置換術后、心房顫動等疾病的血栓栓塞的預防[1]。但華法林治療窗窄， 達到相同的抗凝效果時， 不同個體所需華法林劑量相差可達20倍以上， 用藥時發生出血或栓塞的風險較高， 其不良反應是困擾臨床醫生和患者的普遍問題[2， 3]。研究表明[4]， 患者華法林用藥劑量受遺傳和非遺傳等多個因素的影響， 其中遺傳因素是造成其劑量個體差異的主要原因之一， 在亞洲人群的遺傳因素的影響中， CYP2C9和VKORC1-1639位點基因型是影響華法林需求劑量個體差異的主要因素， 這兩個位點在國內的檢測更具備臨床意義。本研究測定患者CYP2C9、VKORC1-1639位點基因型， 并觀察其多態性對華法林初始抗凝劑量的影響， 現報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取本院2017年2月～2018年2月收治的華法林使用患者200例， 納入標準：①資料完善者;②依從性較好者;③患者疾病為心房顫動、肺栓塞及下肢深靜脈血栓。排除標準：①嚴重肝腎功能異常者;②不愿加入本次研究且不予合作者;③中途退出者;④既往有顱內出血、惡性腫瘤者。其中男127例， 女73例;年齡28～79歲， 平均年齡（51.27±5.14）歲;平均身高（170.17±6.54）cm;平均體重（67.27±6.51）kg。本研究已經過本院倫理委員會批準進行。

1. 2 方法

1. 2. 1 藥品與設備 華法林鈉片（齊魯制藥有限公司， 國藥準字H37021314）， DNA提取試劑盒由Promega（北京）生物技術有限公司提供， 聚合酶鏈式反應（PCR）試劑由大連寶生物技術有限公司提供， DNA測序儀為QIAGEN PymMark Q24焦磷酸測序儀， PCR反應在EPFmdmf5331型熱循環儀上進行。

1. 2. 2 血樣采集與DNA提取 采集研究對象5 ml外周血， 采用全血基因組提取試劑盒的抽提， 操作按試劑盒說明書進行。提取DNA需要用紫外分光光度計測定濃度， 樣品無蛋白或RNA污染， OD260/OD280=1.8～2.0， OD260/OD230≥2.0;DNA含量要求：提取的標本必須≥50 ng/μl;提取完的DNA應立即進行檢測， 否則請于（-20±5）℃保存。PCR反應體系（20 μl）：無菌去離子H2O 15.6 μl， 10×buffer 2.0 μl， 4×dNTPs（10 mmol/L）0.4 μl， 非限制引物2F（10 μmol/L）0.5 μl， 限制引物2R（10 μmol/L）0.1 μl， Taq酶1 U;DNA模板：0.5 μl;分子信標2beaconC（T）（10 μmol/L）：0.5 μl。PCR反應采用兩步法45個循環擴增， 預變性95℃ 3 min， CYP2C9*2和CYP2C9*3：95℃ 5 s， 62℃ 15 s;CYP4F2 V433M、VKORC1 1173C/T和EPHX1：95℃ 5 s， 60℃ 15 s， 最后進行72℃ 2 min延伸。

1. 3 觀察指標 比較研究對象服用華法林初次達標天數、總用量用量和平均每日用量。

1. 4 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG基因型患者初次達標天數分別為（14.47±1.52）、（9.77±0.91）d，?總用量分別為（115.13±11.47）、（56.31±5.49）mg， 平均每日用量分別為（5.22±0.53）、（4.36±0.44）mg， CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者初次達標天數分別為（9.24±0.94）、（5.37±0.52）d， 總用量分別為（52.37±5.14）、（15.56±1.42）mg， 平均每日用量分別為（3.02±0.35）、（3.21±0.36）mg;CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG基因型患者初次達標天數均長于CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者， 總用量及平均每日用量均大于CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者， 差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

3 討論

華法林為臨床最常用的防治血栓栓塞的香豆素類口服抗凝藥， 于20世紀40年代由美國威斯康星大學合成， 因其價格低廉、服用方便、藥效作用持續時間長， 且兼有抗凝和溶栓的雙重作用， 長期作為心臟人工瓣膜置換術后、非瓣膜性心房纖顫或心房撲動、肺栓塞以及深靜脈血栓抗凝治療等一線預防與治療藥物[5， 6]。

臨床上常以PT及INR作為華法林抗凝效果的監測指標。傳統給藥方案需醫生根據多次監測INR值的情況增減華法林劑量直至INR達標， 這種方式導致抗凝療法調整周期長， 期間出血及梗死風險高[7， 8]。近年來的研究顯示[9]， 華法林維持劑量個體差異與基因變異相關。本研究結果顯示， CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG基因型患者初次達標天數分別為（14.47±1.52）、（9.77±0.91）d，?總用量分別為（115.13±11.47）、（56.31±5.49）mg， 平均每日用量分別為（5.22±0.53）、（4.36±0.44）mg， CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者初次達標天數分別為（9.24±0.94）、（5.37±0.52）d， 總用量分別為（52.37±5.14）、（15.56±1.42）mg， 平均每日用量分別為（3.02±0.35）、（3.21±0.36）mg;CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG基因型患者初次達標天數均長于CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者， 總用量及平均每日用量均大于CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者， 差異有統計學意義（P<0.05）。

華法林為混旋體， 全部由肝臟代謝， S-華法林的抗凝活性是R-華法林的3～5倍[10]。華法林的個體化用藥一直是人們關注的焦點。CYP2C9、VKORC1-1639直接影響患者對華法林的敏感性， 導致患者對華法林療效、出血風險產生差異[11]。CYP2C9 *2或*3基因突變可以使得華法林的代謝降低， 其在患者體內蓄積后抗凝作用顯著增強， 可能導致出血等嚴重不良反應。VKORC1是華法林抗凝作用的靶點， 是維生素K依賴性凝血因子生成過程中的限速酶， 其阻礙維生素K由環氧化物形式轉化成氫醌形式， 從而阻斷凝血因子的活化， 產生抗凝作用。VKORC1基因突變患者對華法林敏感性增加， 可能導致華法林抗凝作用增強， 并出現出血等嚴重不良反應。

綜上所述， CYP2C9、VKORC1-1639基因多態性是影響華法林劑量個體和種族差異的重要影響因素， 因此臨床對于需要服用華法林的患者應將INR與CYP2C9、VKORC1基因多態性的檢測相結合， 估測華法林的維持劑量、確保用藥安全。

參考文獻

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[收稿日期：2019-02-21]