一種簡易檢測6-磷酸葡萄糖的方法

徐婷 薛金嫚 陳亞東 劉華 陳鈺佩

摘要：6-磷酸葡萄糖（G6P）是多種代謝途徑的關鍵中間產物，一種簡易高效的G6P測定法建立將有利于深入了解其在有機體中的代謝狀態。前期研究發現，基于離子排斥色譜柱Bio-Rad Aminex HPX-87H與示差折光檢測器的高效液相色譜分析無法有效地將這一化合物與1，6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油酸區分開來。因而，擬建立一種簡便、專一且靈敏，檢測濃度范圍為0.2～10 μmol/L的G6P的酶學熒光檢測法。同時，我們以模式真核生物酵母為材料，對G6P的提取方法進行改進，以使樣本的測定更加穩定。

關鍵詞：6-磷酸葡萄糖;高效液相色譜;酶學熒光檢測;酵母

中圖分類號： Q532+.5? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0209-04

6-磷酸葡萄糖（G6P）是細胞內一種常見的化合物，它由葡萄糖在己糖激酶的作用下生成，在細胞內主要參與3種代謝途徑：（1）進入糖酵解途徑，為生物合成提供細胞能量或碳骨架;（2）進入磷酸戊糖代謝途徑，為細胞提供還原型輔酶Ⅱ（NADPH）和核酸前體;（3）進入糖原合成途徑，為糖原合成提供G1P（葡萄糖-1-磷酸）[1]。因此，G6P是生物代謝途徑的一個關鍵節點，其含量會影響細胞活力。已有研究表明，在磷酸戊糖途徑中，葡萄糖經葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）的作用生成G6P，同時伴隨著NADPH和中間產物的形成，它們在多種生物和非生物脅迫的應答反應中起著重要的作用[2]。

目前，提取動物細胞內G6P的方法有2種，分別為Antonio法[3]和Ritter法[4]，都是使用三乙醇胺溶液提取G6P。測定動物細胞內G6P的方法則有色譜法[5-7]、高效液相色譜法（HPLC）[8]和酶學法[9]。色譜法須要配備昂貴的色譜儀，如Nicolet公司的Magna-IR750傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR），APPLIED SYSTEMS公司的Durasampl IR衰減全反射附件（ATR）[10]。高效液相色譜法雖然可以測定代謝過程中大多數有機酸和糖，但是在試驗過程中發現不能有效分離G6P、果糖-1，6-二磷酸、3-磷酸甘油酸。而酶學熒光定量法[11]通過放大檢測信號，可以提高酶學測定的靈敏度[12-13]和準確性，與高效液相色譜相比，該方法更為有效、經濟。? 目前，在具有細胞壁的真核生物（諸如酵母與植物）中，測定G6P的酶學方法鮮有報道。細胞壁的存在很大程度上增加了G6P的提取難度。本研究試圖以模式真核生物——酵母為材料，建立以6-磷酸葡萄糖脫氫酶酶促反應[14]為基礎的熒光定量法，用于測定細胞內G6P的含量。該方法通過硫辛酰胺脫氫酶作用，使G6PD的產物與刃天青進行反應生成熒光物質[15]，放大G6P信號，從而達到微量檢測的目的。鑒于植物細胞與酵母均存在細胞壁，本研究建立的方法對植物體內G6P的測定也具有一定的指導借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料 Y10000型野生釀酒酵母（Saccharomyces cerevvisiae）BY4742，由筆者所在實驗室保存。

1.1.2 供試試劑 刃天青（Sigma，R7017），三乙醇胺（Sigma，900257），6-磷酸葡萄糖-（Sigma，V900924），6-磷酸葡萄糖脫氫酶（Sigma，A5885），硫辛酰胺脫氫酶（Sigma，D5540），煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（Sigma，NADP-RO），3-磷酸甘油酸（Sigma，P8871），果糖-1，6-二磷酸[生工生物工程（上海）股份有限公司，A60048-0025]，甲醇（Amethyst，116481），三氯甲烷（上海凌峰化學試劑有限公司，分析純），硫酸（西隴化工股份有限公司，分析純）。

1.1.3 供試儀器 小型臺式離心機（Eppendorf 5424），-80 ℃ 低溫冰箱（Thermo Fisher Scientific TSE240V），-20 ℃ 低溫箱（SANYO MDF-U539-C），多功能酶標儀（*synergyH1），高速冷凍離心機（*CF16RXⅡ），真空冷凍干燥機（D-37520），高效液相色譜儀（Agilent1200型）配RID檢測器、Agilent色譜工作站（美國安捷倫科技有限公司），離子排斥色譜柱（Bio-Rad Aminex HPX-87H）。

1.2 酵母細胞培養

在30 ℃條件下，將細胞置于缺尿嘧啶（URA）的固體葡萄糖SC培養基板上培養2 d左右，然后選取單菌落于3 mL液體半乳糖SC培養基中培養1 d。測定D600 nm后轉接至 10 mL 液體半乳糖SC培養基中，D600 nm=0.05，培養約10 h左右，取D600 nm=1.00的菌液10 mL（細胞數約為2.0×108，干質量為 28 mg），5 000 g、離心5 min后棄上清，用預冷的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌并懸浮細胞，再轉移至2 mL離心管中離心后棄上清，于-80 ℃保存。

1.3 提取方法

1.3.1 Antonio法 G6P的提取方法參照Antonio等的報道[3]，取細胞數為2.0×108（干質量為28 mg）左右的酵母細胞用1 mL PBS溶液洗滌2次，去上清，然后加入1 mL預冷的甲醇/三氯甲烷混合液（體積比為2 ∶ 1），混合后渦旋，于 -20 ℃ 靜置2 h，加入 500 μL 50%甲醇溶液（4 mmol/L tricine兩性離子緩沖液，pH值為5.4），18 000 g、4 ℃離心 10 min，轉移上層水相，用1 mL 50%甲醇溶液對三氯甲烷相進行再次提取。合并2次提取液，在高速冷凍離心機中干燥后于-80 ℃保存。

1.3.2 Ritter法 G6P的提取方法參照Ritter等的報道[4]，取細胞數為2.0×108（干質量為28 mg）左右的酵母細胞用 1 mL PBS溶液洗滌2次，去上清，加入600 μL 50%甲醇溶液（4 mmol/L tricine兩性離子緩沖液，pH值為5.4），超聲波處理5 min，重復1次后轉移至2 mL離心管中，加入600 μL三氯甲烷，渦旋振蕩30～60 s，收集提取液約1 mL。最后，在真空離心干燥機中干燥后于-80 ℃保存。

1.3.3 Antonio改進法 在Antonio法的基礎上進行改進，取細胞數為2.0×108（干質量為28 mg）左右的酵母細胞用 1 mL PBS溶液洗滌2次，去上清，加入200 μL預冷的甲醇/三氯甲烷混合液（體積比為2 ∶ 1），0.3 g酸洗過的玻璃珠（直徑為0.2～0.4 mm）渦旋儀振蕩6 min（30 s冰上，30 s渦旋交替），加入500 μL 50%甲醇溶液（4 mmol/L tricine兩性離子緩沖液，pH值為5.4），18 000 g，4 ℃ 離心10 min，轉移上層水相，用1 mL 50%甲醇溶液對三氯甲烷相進行再次提取。合并2次提取液，加入等體積的ddH2O，于-80 ℃冷凍后轉移至真空冷凍干燥機，干燥完全后于 -20 ℃ 保存。

1.3.4 Ritter改進法 在Ritter法的基礎上進行改進，取細胞數為2.0×108（干質量為28 mg）左右的酵母細胞用1 mL PBS溶液洗滌2次，去上清，加入200 μL預冷的50%甲醇溶液（4 mmol/L tricine兩性離子緩沖液，pH值為5.4），0.3 g酸洗過的玻璃珠（直徑為0.2～0.4 mm）渦旋儀振蕩6 min（30 s冰上，30 s渦旋交替），再次加入800 μL 50%甲醇溶液，1 mL三氯甲烷，混勻離心后取上層水相，18 000 g，4 ℃，離心 10 min。提取物中加入等體積的ddH2O，于-80 ℃冷凍后轉移至真空冷凍干燥機，干燥完全后于-20 ℃保存。

1.4 G6P的熒光檢測法

將提取物溶于50 μL ddH2O中，取10 μL樣品或G6P的標準品（濃度依次為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0和10.0 μmol/L）于96孔板中，加入90 μL混合液：50 mmol/L的三乙醇胺（TEA）（pH值為7.6）、1.0 mmol/L MgCl2、100 μmol/L NADP+、10 μmol/L 刃天青、0.1 U/mL G6PD和0.2 U/mL硫辛酰胺脫氫酶。反應液在室溫條件下靜置30 min后，在激發光530 nm、熒光590 nm條件下進行檢測，對照組以TEA替代G6PD，其余條件保持一致。對照組的熒光檢測值為非G6P的干擾物質造成的熒光讀數。

1.5 高效液相色譜檢測法

1.5.1 色譜條件 離子排斥色譜柱：Bio-Rad Aminex HPX-87H型（300 mm×7.8 mm，9 μm），流動相為5 mmol/L H2SO4溶液，流量為0.6 mL/min，柱溫為60 ℃，檢測器為RID，進樣體積為20 μL。

1.5.2 標準品及混合標準品溶液的配制 用超純水分別配制濃度為1 g/L的1，6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油酸和6-磷酸葡萄糖標準品以及混合標準品的儲備溶液，然后按0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、16.0、32.0、64.0 mmol/L的濃度配制G6P標準溶液以確定其測定范圍，接著按照“1.5.1”節中的色譜條件進行分析。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜法檢測G6P的非專一性

HPLC常用于糖濃度的測定，在檢測過程中，G6P標準品的保留時間和1，6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油酸極為接近。如圖1所示，1 g/L 1，6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油酸和 6-磷酸葡萄糖標準品的保留時間分別為 5.928、6.365、

6.210 min，峰面積分別為368 984、231 419、232 975 mAU·min，而混合樣品中只出現1個保留時間，為6.115 min，峰面積為736 738 mAU·min（面積約為3種標準品面積之和）。HPLC難以有效區分以上3種物質，因此無法通過該方法測定細胞內G6P的濃度。

2.2 酶學熒光檢測法的建立

酶學熒光檢測法是通過放大酶學信號，以檢測G6P的微量變化。如圖2所示，游離態G6P在G6PD的作用下形成 6- 磷酸葡萄糖內酯，并將NADP+還原生成NADPH，而NADPH在硫辛酰胺脫氫酶的作用下可以與刃天青反應，生成熒光性物質。G6P濃度的計算公式如下：

G6P濃度=（試驗值-背景值）-標準曲線的截距標準曲線的斜率×樣品質量×稀釋倍數。

其中，背景值（即沒有加6-磷酸葡萄糖脫氫酶處理）代表樣品中含有的游離態NADPH及其他干擾物質的含量;試驗值（即加入6-磷酸葡萄糖脫氫酶處理）代表樣品中G6P和干擾物質的含量。

利用標準品制作G6P標準曲線，試驗重復2次，如圖3所示，在0.2～10.0 μmol/L濃度范圍內，G6P含量和反應產物的熒光強度呈線性關系，且標準誤差值較低。為避免系統誤差對試驗結果的影響，每次測定G6P的含量時均重新制作標準曲線。使用HPLC測定G6P時，樣品量至少為1 mL，檢測濃度范圍為0.4～32.0 mmol/L，而酶學熒光檢測法只需 10 μL 的樣品，檢測的摩爾濃度范圍為0.2～10.0 μmol/L。說明使用酶學熒光檢測法測定G6P，靈敏度高，穩定性好，對待測樣品中G6P的濃度要求低。

2.3 G6P提取方法的優化

Antonio法和Ritter法是目前已知可以提取細胞內G6P的2種方法[3-4]，其分別采用凍融和超聲波處理方式來破碎動物細胞，但這2種方法均無法完全破碎酵母細胞，在濃縮提取液時，高速離心濃縮須持續離心24 h且效果不佳。為解決上述問題，在Antonio法和Ritter法的基礎上本研究使用玻璃珠和凍干機進行細胞破碎和提取液凍干處理。如圖4所示，在Antonio法和Ritter法的基礎上進行改進，結果發現Antonio改進法與其他3種方法得到的G6P濃度存在極顯著差異。已有文獻報道，動物細胞內G6P含量約為 714 pmol/mg DW，Antonio法和Ritter法所測得的G6P濃度僅分別為211.8、264.9 pmol/mg DW，且標準誤差大，這2種方法可行性較低[3]。Antonio改進法和Ritter改進法測得的G6P濃度分別為774.0、 365.8 pmol/mg DW。因此，使用Antonio改進法-酶學熒光定量檢測法可有效測定酵母體內G6P的濃度。

經研究推測，Antonio改進法提取效率高的原因是（1）通過玻璃珠使酵母細胞破碎完全，可提高所測定的G6P濃度值，此方法也適用于含有細胞壁的植物細胞;（2）提取的過程中先加入三氯甲烷，可以破壞細胞膜引發細胞死亡，使細胞內的相關酶瞬間失活，從而減少了由G6P降解所引起的損耗;（3）通過真空凍干機對樣品進行冷凍干燥處理，由于冷凍干燥機可以將溫度維持在-20 ℃以下，以保證將所有樣品凍干至粉末狀，大大提高了提取效率。

3 結論

本試驗在原有測定G6P方法的基礎上進行適度改進，從而建立了適用于具有細胞壁細胞的提取方法。此方法亦可應用于植物細胞中，但由于植物細胞比酵母細胞結構更為復雜，還須要進一步試驗以摸索并改善相關條件。該方法除了可用于測定G6P的含量，還可用于胞內NAD+和NADPH含量的測定。由于目前普遍使用試劑盒檢測動物細胞內NAD+和NADPH的含量，但試劑盒法并不適用于大樣本及植物細胞的測定，而使用Antonio改進法-酶學熒光定量檢測法可以大大降低成本，并為進一步測定具有細胞壁的細胞體內NAD+和NADPH的濃度提供借鑒。

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