鎘對河蟹抗氧化酶活性的影響

趙亞玲 藺翠翠

摘 要：本文采用生態學單因子梯度試驗方法，將河蟹暴露于不同Cd2+濃度（0、0.5、1.15、3.17毫克/升）96小時，研究鎘對河蟹肝胰腺和鰓的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽硫轉移酶（GST）酶活性的影響和損傷，旨在探明重金屬鎘對抗氧化酶系統的影響。結果顯示：河蟹體內抗氧化系統對鎘脅迫較為敏感，其抗氧化酶活性的變化可以靈敏地反應鎘的脅迫程度和毒性，隨著鎘脅迫時間和濃度的增加，三種酶的活性呈現出先被激活后被抑制的規律。

關鍵詞：鎘;河蟹;抗氧化酶

河蟹，學名中華絨螯蟹，屬軟甲綱（Malacostraca），十足目（Decapoda），弓蟹科（Varunidae），絨螯蟹屬，集中分布于我國北至遼寧，南至福建閩江口，是我國特有的大型淡水蟹類。河蟹因其個大體肥、膏滿黃多、肉質鮮嫩而深受我國廣大消費者的青睞。肝胰腺和鰓是河蟹的兩大重要器官，肝胰腺是河蟹體內重要的解毒器官，發揮著降低和消除外源有害物質的作用;鰓是河蟹體內重要的呼吸器官，發揮著調節體內滲透壓和平衡離子的作用。酶是生物體中一類生物大分子的總稱，在呼吸、運動、消化、吸收、代謝、生殖等所有生命活動中起著舉足輕重的作用，酶活的變化能快速且靈敏的反映環境脅迫對生物體的影響。

鎘是一種藍白色金屬，由于其密度大于4.5克/立方厘米，被歸類為重金屬。重金屬鎘是當今世界上三大重點研究的毒素之一。早在1984年，鎘就位列聯合國環境規劃署提出的12種具有全球性意義的危害化學物質之首。國際癌癥研究機構（IARC）將其歸為人類和實驗動物中肺癌和前列腺癌的確認致癌物。大部分鎘化物可溶于水，通過呼吸、消化、體表滲透等途徑被吸收到水生生物體內，引起水生生物的急慢性反應。進入水生生物體內的鎘離子，通過誘導作用使水生生物產生大量氧自由基（ROS），導致機體受損。生物體內的抗氧化系統是機體的重要防御系統，是清除外源物質產生的氧自由基的第一道防線。為了探明重金屬鎘對抗氧化酶系統的毒性影響程度與致毒機制，本文就不同濃度鎘對河蟹肝胰腺和鰓組織細胞中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽硫轉移酶（GST）酶活性的影響進行了研究，為水產品的安全養殖提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

電動勻漿機（IKA TIGITAL）、電子天平（Sartorius，CP224S）、均質器（IKA T18 DIGITAL）、低溫冷凍離心機（TGL-20B）。鎘標準品：濃度為1000毫克/升，購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

1.2 實驗動物

河蟹：盤錦水產技術推廣站提供，平均濕重（50.3±0.52）克，雌雄各半，放入塑料養殖箱（42厘米×31厘米×26厘米）中暫養5天，選擇大小適宜、健康無病、活動正常的河蟹150只備用。

1.3 實驗設計

本課題組在前期對鎘引起的河蟹半致死量（LD50）的研究基礎上，將本文酶活實驗設計為3個添加組和1個空白組，3個添加組的濃度分別為0.5、1.15和3.17毫克/升，每個濃度組設2個平行。實驗采用42厘米×31厘米×26厘米大小的塑料養殖箱并上覆薄膜封口以保證養殖水體中鎘濃度的恒定，各養殖箱中加入5升含有不同濃度鎘的養殖水，水溫（21±2）℃，溶解氧>8.0毫克/升，自然光照，連續充氣增氧。實驗期間不喂食，及時清理死亡個體。

1.4 實驗方法

樣品制備：鎘脅迫96小時之后，每個平行組隨機選取3～5只河蟹，迅速取出肝胰腺和鰓，在玻璃勻漿器中加入9倍體積的預冷生理鹽水，冰浴勻漿組織10分鐘，勻漿后于離心機上離心10分鐘（2500rpm），上清液冷凍保存用于測定酶活。酶活測定：采用“南京建成”試劑盒測定SOD、CAT和GST酶活和總蛋白量，酶活單位為U/毫克蛋白。

1.5 數據統計

結果采用2平行組的平均值±標準差（Mean±SD）表示，顯著性檢驗用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA）和多重比較（Duncan法），差異顯著臨界值為0.01。

2 結果

2.1 鎘對河蟹肝胰腺和鰓SOD酶活性的影響

不同濃度鎘對河蟹肝胰腺和鰓的SOD酶活性影響見圖1。肝胰腺空白組的SOD酶活為106U/毫克蛋白，低濃度組（0.5毫克/升）酶活為158U/毫克蛋白，顯著高于對照組（P<0.01），中高濃度組酶活分別降至82和60U/毫克蛋白，顯著低于對照組（P<0.01）。腮的低濃度組（0.5毫克/升）SOD酶活被明顯激活，SOD達164U/毫克蛋白，顯著高于對照組的120U/毫克蛋白（P<0.01），隨著鎘脅迫濃度的增大，高濃度組（3.17毫克/升）河蟹腮的SOD酶活被抑制，酶活僅為空白組的50%，為72U/毫克蛋白。由此可見，隨著鎘脅迫濃度的增大，鎘對河蟹肝胰腺和腮中SOD酶的作用總體均呈現出先激活再抑制的趨勢。

2.2 鎘對河蟹肝胰腺和鰓CAT酶活性的影響

不同濃度鎘對河蟹肝胰腺和鰓的CAT酶活性影響見圖2。與SOD類似，鎘脅迫后肝胰腺和鰓的CAT酶活性也發生了明顯的變化，總體規律為先激活后抑制，由圖2可以看出，低濃度組（0.5毫克/升）肝胰腺和鰓中CAT酶活均有明顯升高，分別為6.6和6.3U/毫克蛋白，顯著高于空白組（P<0.01），隨著鎘脅迫濃度的增大，肝胰腺和鰓的CAT酶活逐漸被抑制，高濃度組（3.17毫克/升）脅迫96小時后CAT酶活已從激活態逐漸回落，酶活性與空白組相當。

2.3 鎘對河蟹肝胰腺和鰓GST酶活性的影響

不同濃度鎘對河蟹的肝胰腺和鰓GST酶活影響見圖3。鎘對河蟹肝胰腺GST酶活的影響趨勢與SOD和CAT相似，對照組GST酶活為132U/毫克蛋白，低濃度組酶活為163U/毫克蛋白，與對照組相比差異顯著（P<0.01），中、高濃度組GST酶活力分別升至149和118U/毫克蛋白，與對照組差異極顯著（P<0.01）。鰓GST酶與肝胰腺規律一致，鰓對照組GST酶活為138U/毫克蛋白，低濃度組GST酶活升高為172U/毫克蛋白，中濃度組酶活降至136U/毫克蛋白，繼續降至高濃度組的103U/毫克蛋白。

3 討論

鎘是一種常見的環境污染物，能夠刺激生物體產生大量的活性氧。SOD是生物體防御內外環境中氧自由基（O2-）侵害的第一道防線，能夠靈敏反映外界對生物體的損傷。本文結果顯示，隨著鎘脅迫濃度的升高，河蟹肝胰腺和鰓中SOD活性呈現出先被激活隨后被抑制的趨勢，這與李涌泉、王蘭等的研究結果一致。SOD為底物誘導酶，低濃度的鎘脅迫致使河蟹體內產生大量O2-誘導SOD大量產生以清除O2-對機體造成的損害，因此，低濃度的Cd誘導SOD活性增強。中高濃度組的Cd2+能夠與河蟹體內細胞質和線粒體中Cu/Zn-SOD和Mn-SOD發生置換，形成Cd-SOD改變其分子構想，致使SOD酶活降低。

過氧化氫酶（CAT）在機體清除多余的自由基過程中扮演著重要的角色，低濃度鎘脅迫時，河蟹體內H2O2和羥自由基（-HO）含量增加，SOD酶被激活的同時，CAT合成被激活，共同清除過量H2O2保護機體。本實驗同樣得出，當河蟹受到低濃度鎘脅迫時SOD酶活升高，同時CAT酶被激活，其酶活高于空白組50%以上，這與其他甲殼類動物的研究結果也保持一致，從CAT和SOD的作用機理同樣可以得出兩類酶活變化應保持同步的結論。然而，隨著鎘脅迫濃度的升高，CAT活力未降低至空白組以下，而是維持在空白組的酶活范圍內，這可能與鎘未對CAT造成類似SOD分子構想的改變的影響有關。

GST是一類多功能解毒酶，GST的多功能性使它在機體解毒代謝中起著十分重要的作用。特定的GST亞基對致癌性異生物質有特異的高催化活性，能夠催化GSH（谷胱甘肽）與機體中被氧化的-SH反應使其再生。本實驗結果顯示，低濃度的Cd2+對GST酶活表現出激活作用，此時GST能夠與低濃度的Cd2+結合，從而降低對河蟹機體的氧化損傷，但隨著Cd2+濃度的升高，Cd2+的累積毒性增加，原有GST活性中心遭到嚴重破壞，新的GST難以合成，活力降至正常范圍以下。

4 結論

河蟹體內的抗氧化系統對鎘脅迫具有較高的敏感性，SOD、CAT和GST酶對降低鎘引起的氧化損傷具有積極作用。抗氧化酶系統中SOD、CAT和GST的活力隨鎘脅迫的時間和濃度發生規律性變化，隨著時間和濃度的增加，3種酶的活力呈現出先激發后抑制的規律。

作者簡介：趙亞玲，高級農藝師。