CD19+CD24highCD38high調節性B細胞及相關細胞因子在視神經脊髓炎譜系疾病患者外周血中的變化及意義

董 梅，史肖鶴，王 煒，李世平，侯慧清，吳冰潔

視神經脊髓炎譜系疾病(Neuromyelitis optica spectrum disorders，NMOSD)是中樞神經系統(Central nervous system，CNS)炎性免疫性疾病，反復發作，主要為視神經炎、長節段橫貫性脊髓炎和顱內典型部位[1]，中國、日本等亞洲地區患病顯著高于歐美等國家[2,3]。常導致失明、截癱等，是我國青壯年致殘的重要原因之一。因此，探索其發病機制，尋找潛在的治療靶點尤為關鍵。

水通道蛋白4(Aquaporin 4,AQP4)抗體(AQP4-Ab)是NMOSD特異性抗體，在NMOSD發病機制中占據重要作用[4]。2015年修訂診斷標準將NMOSD分為AQP4抗體陽性和陰性兩類，AQP4抗體陰性 NMOSD可能包含其他異質性致病因素[5]。AQP4-Ab與血腦屏障(Blood brain barrier,BBB)的星形膠質細胞足突成分 AQP4特異性結合，在補體參與下，導致嚴重的星形膠質細胞(astrocyte,AS)損害，使AQP4和其標志性成分膠質纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)大量丟失，形成NMOSD根本性病理損害-星形膠質細胞病(Astrocytopathy)[6]。上述證據表明：B細胞是NMOSD發病機制中重要參與者。作為AS重要組成成分，血清GFAP含量變化可以間接反應腦組織損傷程度。

B細胞除產生特異性抗體外，還有多種“抗體非依賴性(Antibody Independent) ”功能，例如，新近發現部分B細胞亞群具有免疫調節作用，稱為“調節性B細胞”(Regulatory B cell,Breg)，主要通過分泌IL-10、TGF-β發揮免疫抑制作用，大量研究表明Breg在NMOSD急性期起重要作用。

本研究主要測定AQP4-Ab陽性的急性期NMOSD患者及健康對照組人群外周血CD19+CD24highCD38highBreg數量，以及血清IL-10、TGF-β的mRNA含量水平，進一步探討Breg在NMOSD急性期的數量變化及功能，以及與EDSS評分之間的關系；通過對外周血GFAP測定及EDSS評分，探討GFAP是否與疾病殘疾程度有關。

1 材料和方法

1.1 研究對象 選取2016年12月-2017年12月就診于河北醫科大學第二醫院東院區神經內科的27例急性期NMOSD患者為實驗組(急性期：患者出現新的神經系統癥狀體征，持續時間大于24 h不緩解，EDSS評分增加≥1分)，同期選取性別、年齡相似的20位健康志愿者作為對照組。所有患者均經由我科主治及以上資質的醫師診斷，符合最新NMOSD指南制定的診斷標準。本實驗研究征得患者或家屬同意，所有患者均在治療前抽取外周血。

1.2 標本采集 患者急性期入院后，抽取晨起空腹靜脈血兩管，各2 ml，分別置于檸檬酸鈉管、EDTA管中，檸檬酸鈉管內血于-80 ℃冰箱保存備用。EDTA管靜脈血立即送血液科實驗室進行CD19+CD24highCD38highBreg檢測，檸檬酸鈉管標本冷存于-80 ℃，用于檢測IL-10、TGF-β、GFAP的mRNA水平。

1.3 研究方法

1.3.1 臨床資料收集 記錄所有研究對象的基本信息，包括：姓名、性別、年齡、病程、EDSS評分、AQP4抗體結果等。

1.3.2 應用SYBR GreenⅠReal-time PCR方法檢測血液中IL-10、TGF-β及GFAP的 mRNA含量，實驗操作按產品說明書進行。

1.3.2.1 Real Time PCR檢測目的基因引物均在北京Invitrogen公司合成。

1.3.2.2 提取樣本總RNA：采用Trizol法提取樣本總RNA，使用NanoDrop?ND-2000分光光度計測定RNA濃度和純度。

1.3.2.3 逆轉錄合成cDNA：采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser方法進行，步驟一，去除基因組DNA反應：于冰上配制反應混合液，5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μl，gDNA Eraser1.0 μl，Total RNA 1 μg，加RNase Free H2O至總體積10 μl，42 ℃孵育2 min。步驟二，反轉錄反應，上述反應液加入PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0 μl，RT Primer Mix 1.0 μl，5×PrimeScript Buffer 2 4.0 μl，RNase Free H2O 4.0 μl，共20 μl，37 ℃孵育15 min，之后放入85 ℃ 5 s，cDNA保存至-20 ℃冰箱備用。

1.3.2.4 Real Time PCR樣本檢測 將所有cDNA樣品分別配置RT-PCR反應體系。體系配置如下：2 × Master Mix 10 μl，10 μmol的PCR特異引物F 0.5 μl，10 μmol的PCR特異引物R 0.5 μl，加水至總體積為18 μl 5000 rpm短暫離心。將18 μl 混合液、2 μl cDNA依次加入96-PCR板對應的每個孔中，混勻，置于Real time PCR儀上進行PCR反應，95 ℃，30 s；40個PCR循環95 ℃，5 s；60 ℃，40 s(收集熒光)。建立PCR產物的熔解曲線，從60 ℃緩慢加熱到99 ℃。將目的基因和內參分別進行Real time PCR反應，每個樣本進行3個復孔檢測。儀器自動匯總熒光值后進行分析。

1.3.3 血清CD19+CD24highCD38highBreg水平測定 患者EDTA管靜脈血送至河北醫科大學第二醫院血液內科實驗室采用流式細胞學方法測定血清CD19+CD24highCD38highBreg水平。

2 結 果

2.1 研究對象的一般資料 NMOSD患者共27例，女性20例，平均發病年齡44歲(19～62歲)，患者均符合NMOSD診斷標準，平均EDSS評分3.59分，NMO-IgG陽性率75%。對照組20例，均為女性，平均發病年齡，41歲(20～64歲)，兩組性別、年齡無統計學差異。

2.2 NMOSD急性期患者與健康對照組CD19+CD24highCD38highBreg相比下降，差異有統計學意義(P<0.05)。Breg水平與EDSS評分不存在線性相關關系(見圖1、圖2)。

2.3 NMOSD急性期患者與健康對照組血清IL-10、TGF-β的mRNA水平相比下降，差異均有統計學意義(P<0.05)(見圖3、圖4)。

2.4 NMOSD急性期患者與健康對照組血清GFAP水平相比升高，差異有統計學意義(P<0.05)。GFAP與EDSS評分之間無線性相關關系(見圖5、圖6)。

圖1 NMOSD急性期患者為實驗組，健康者為對照組，兩組血液中CD19+CD24highCD38highBreg數量比較實驗組明顯降低P<0.05

圖2 血液中CD19+CD24highCD38highBregs數量與EDSS評分無相關關系

圖3 NMOSD急性期患者為實驗組，健康者為對照組,兩組血液中IL-10 mRNA水平比較實驗組明顯降低P<0.05

圖4 NMOSD急性期患者為實驗組，健康者為對照組,兩組血液中TGF-β mRNA水平比較實驗組明顯降低P<0.05

圖5 NMOSD急性期患者為實驗組，健康者為對照組，兩組血液中GFAP mRNA水平比較實驗組明顯升高P<0.05

圖6 血液中GFAP含量與EDSS評分無相關關系

3 討 論

B細胞是NMOSD發病重要因素，B細胞一個重要特征是激活后產生抗體。 其活化后大量增殖并分化為效應B細胞亞群(漿細胞)和記憶B細胞亞群(Memory B cell,Bmem)，漿細胞能分泌特異性抗體，中和抗原執行免疫保護功能，也可因攻擊具有免疫原性的自體組織導致自身免疫性疾病發生[7]。Bmem則在再次受刺激后， 直接增殖、分化為漿細胞，產生大量抗體。此外，B細胞還有多種“抗體非依賴性”功能，包括抗原呈遞、分泌各種細胞因子和趨化因子等。新近發現部分B細胞亞群具有免疫調節作用。Mizoguchi等[8]首次將具有免疫抑制特性的B細胞亞群定義為“調節性B細胞”(Breg)。大量研究提示Breg參與了自身免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤等眾多疾病的發病過程，Breg可抑制炎癥反應細胞如DC細胞、T細胞的免疫應答，同時可促進Treg細胞的抑制炎癥反應作用，并誘導Treg活化[9]。

目前發現，CD19+CD24highCD38highB 細胞、CD19+CD24+CD27+B細胞和CD19+CD1d CD5+B細胞是人類Breg的3種表型[10]。主要通過分泌IL-10、TGF-β、IL-35發揮免疫抑制作用，其中IL-10被認為是鑒定Breg的特征性標志[11]。其中，CD19+CD24highCD38highBreg于2010年由英國倫敦大學學院Blair等[12]證實，隨后研究證實該表型Breg在多種自身免疫相關性疾病的患者外周血中數量降低且功能受損，表現為抑制性細胞因子IL-10分泌減少，從而抑制Th1細胞因子和誘導Th2細胞因子的能力降低。NMOSD患者Breg不同表型及相關細胞因子表達情況及其作用機制尚不清楚。故我們研究了CD19+CD24highCD38highBreg在NMOSD急性期患者中的變化。

我們的研究發現在AQP4-Ab陽性的NMOSD急性期患者外周血中Breg數量較健康對照組顯著下降，與之前國內外學者的報道相一致。研究證明Breg通過分泌IL-10、IL-35、TGF-β等炎癥抑制細胞因子，實現負向免疫調控，保障免疫平衡。Breg可通過分泌IL-35、TGF-β誘導B細胞分泌IL-10；通過分泌TGF-β及膜表面的CD80/CD86、GITRL誘導調節性T細胞生成；通過分泌IL-10促進輔助性T細胞向Th2分化并且抑制其向Th1的分化[13]。Breg及其細胞因子可與T細胞、單核細胞等之間進行動態、多樣的相互作用，在免疫調節發揮至關重要的作用[14]。

IL-10是重要的抗炎細胞因子，對免疫反應的調控主要是通過抑制過度炎癥反應實現。IL-10可誘導Th0向Th2發育，誘導Th2細胞因子，并通過抑制Th1細胞因子進一步抑制Th1發育，影響Th1/Th2平衡，阻止抗原呈遞。單核細胞及巨噬細胞產生促炎因子，抑制樹突細胞分泌細胞因子如IL-6、IL-12，因IL-12水平下降可抑制EAE進程，故IL-10/IL-12平衡在EAE發病過程中起重要調節作用。IL-10通過下調促炎性細胞因子、共刺激分子的表達，從而效應T細胞激活減少，進而發揮負向調節作用[15]。TGF-β抑制可細胞毒性T淋巴細胞、Th1型和Th2型細胞分化，促進外周血樹突狀細胞、Th17-、Th9-和Tfh-細胞的產生，在維持自身耐受性，控制免疫應答方面發揮著關鍵作用[16]。有研究采用CD8+CD103+iTreg過繼轉移治療典型狼瘡綜合征的慢性移植物抗宿主病，表明可降低自身抗體和蛋白尿水平，減少腎臟病理損害，提高存活率，提示可能與TGF-β和IL-10信號，直接抑制B細胞反應有關。TGF-β在Bregs發揮負向免疫調節作用中占有不可忽視的地位[17]。此外，Breg可能通過產生TGF-β增強Treg的擴增[18]。

我們的研究證實NMOSD患者急性期外周血中IL-10和TGF-β的含量較健康對照組明顯降低，上述研究結果提示NMOSD患者外周血Breg不僅數量減低，在功能上也存在異常，急性期免疫活性增強，免疫平衡紊亂，大量炎癥因子激活，而相應抑制功能下降，造成組織損傷，這可能是NMOSD發病機制的重要組成部分。

NMOSD急性期AQP4抗體通過受損的BBB與AS足突表面的AQP4特異性結合， AS受損，GFAP作為AS的重要組成部分，釋放入細胞間隙，通過BBB進入外周血，研究表明NMOSD患者中CSF中的GFAP濃度顯著高于血清，血清中GFAP含量變化的研究相對少見，也較對照組水平增加[19]。我們的研究表明NMOSD患者急性期外周血中GFAP水平較健康對照組顯著升高，與既往研究結果相一致，反應AS損害，BBB破壞，腦組織內發生炎性損傷。但我們的研究并未發現血清GFAP水平與EDSS評分之間具有明確相關性，分析原因可能為，本組患者大部分為復發患者，EDSS評分為多次復發后累積殘疾評分，而檢測的血清GFAP僅為此次免疫損傷后AS破壞的反應，故GFAP不能作為生物學指標反應復發的NMOSD患者病情嚴重程度及預后。