異氟烷預處理對偏頭痛大鼠行為學癥狀及三叉神經節相關蛋白表達的影響

周 偉，劉志剛

偏頭痛是一種具有高發病率且反復發作的神經血管紊亂性疾病，嚴重影響人們的生活質量[1]。目前研究普遍認為偏頭痛發病機制與三叉神經血管系統的激活有關，其中神經源性炎癥是關鍵環節[2,3]。現有研究表明核轉錄因子-κB (nuclear factor-kappaB,NF-κB )及其下游炎性因子白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、環氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX2)以及降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)在神經源性炎癥反應中發揮重要作用，且與偏頭痛的發生密切有關[4～7]。

異氟烷(isoflurane，ISO)是廣泛應用的吸入麻醉藥，在神經系統急性損傷的過程中發揮抗氧化應激、抗凋亡及抗炎等作用[8,9]，因此推測其可能抑制偏頭痛過程中的神經源性炎癥和凋亡過程。

目前關于異氟烷作用于偏頭痛三叉神經源性炎癥的研究相對較少，本研究擬通過分析異氟烷處理對偏頭痛大鼠行為及三叉神經節內IL-1β、NF-κB p65、COX-2及CGRP蛋白表達的影響，探討可能涉及到的病理機制，為臨床偏頭痛的治療提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年健康雄性SD大鼠40只，8～10 w齡，體質量220～250 g，由鄭州大學實驗動物中心提供。所有動物實驗均通過河南大學第一附屬醫院倫理委員會批準通過。

1.2 實驗方法 采用隨機數字表法將SD大鼠分為對照組(S組)、模型組(M組)、ISO預處理組(包括低劑量組和高劑量組，即L組和H組)，每組10只。參照Tassorelli等[10]報道的方法制造偏頭痛動物模型，即將除S組外的所有大鼠頸部皮下注射硝酸甘油10 mg/kg；S組給予等體積的生理鹽水注射。以造模后大鼠出現雙耳發紅、前肢頻繁撓頭、爬籠次數增多、咬尾、往返運動等煩躁不安的癥狀視為造模成功，本研究中除S組外的所有大鼠均造模成功。ISO(100 ml/瓶，國藥準字H20020267，魯南貝特制藥有限公司)處理方法：L組和H組大鼠在接受造模前30 min分別給予1%和2%ISO吸入30 min，M和S組不進行ISO吸入處理。

1.3 行為學檢測 (1)造模后觀察大鼠耳紅出現和消失的時間；(2)從完成造模時開始至造模后210 min的時間段內，以每30 min為一個時間區間，觀察并記錄各組大鼠各時間段(T1-7)的撓頭、爬籠次數[11]。

1.4 Western blot檢測蛋白表達水平 建模后4 h，采用3.5%的水合氯醛腹腔注射深度麻醉大鼠，斷頭分離三叉神經節，于-80 ℃冰箱保存。分別采用細胞核蛋白和細胞漿蛋白抽提試劑盒提取心肌組織核蛋白和胞漿蛋白，嚴格按照試劑盒說明書操作。其中胞漿蛋白用于檢測IL-1β、NF-κB p65、COX-2及CGRP蛋白的表達水平，胞核蛋白用于胞核NF-κB p65蛋白的表達。BCA法測定蛋白濃度后。分別取20 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，當指示劑到達距凝膠下端約0.5 m處時關閉電源，取出膠板轉膜(PVDF膜)，采用5%BCA室溫封閉2 h，分別加入NF-κB p65抗體、IL-1β抗體、COX-2抗體、CGRP抗體、β-actin抗體和TBP 抗體(1∶1000) 4 ℃孵育過夜，然后室溫孵育羊抗兔或羊抗鼠二抗(1∶2000)1 h。化學發光顯影后采用Image J計算目的條帶與內參條帶灰度值的比值，即目的蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1 大鼠行為學癥狀的改變 與S組相比，M組和ISO預處理組大鼠均出現雙耳發紅及撓頭、爬籠次數增多等現象，差異有統計學意義(P<0.05)；ISO預處理組大鼠耳紅消失的時間較M組明顯縮短，T2-7時撓頭次數均明顯減少，T2-6時爬籠次數均明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)(見表1～表3)。

2.2 三叉神經節內 IL-1β、COX-2及CGRP蛋白表達水平比較 M組大鼠與S組相比，IL-1β、COX-2及CGRP蛋白表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)； ISO預處理組大鼠隨著劑量的增加，與M組相比，IL-1β、COX-2及CGRP蛋白表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)(見圖1)。

2.3 三叉神經節內NF-κB p65蛋白表達水平比較 M組大鼠三叉神經節內NF-κB p65胞核蛋白水平較S組明顯升高，胞漿蛋白水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；ISO預處理組與M組比NF-κB p65胞核蛋白水平明顯降低，且呈劑量依賴性，而胞漿NF-κB p65蛋白水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)(見圖2)。

表1 各組大鼠出現耳紅及耳紅消失的時間比較

與S組比較*P<0.05;與M組比較#P<0.05;與L組比較&P<0.05

表2 各組大鼠各時間段撓頭次數比較(次

與S組比較*P<0.05;與M組比較#P<0.05;與L組比較&P<0.05

表3 各組大鼠各時間段爬籠次數比較(次

與S組比較*P<0.05;與M組比較#P<0.05;與L組比較&P<0.05

與S組比較*P<0.05;與M組比較#P<0.05;與L組比較&P<0.05

圖1 各組大鼠三叉神經節內IL-1β、COX-2及CGRP蛋白表達水平比較

與S組比較*P<0.05;與M組比較#P<0.05;與L組比較&P<0.05

圖2 各組大鼠三叉神經節內NF-κB p65在胞核及胞漿中的表達水平比較

3 討 論

偏頭痛是最常見的頭痛類型，且多發于中青年人群，嚴重影響患者的工作和生活。偏頭痛的發病機制較為復雜，與遺傳、內分泌代謝、精神壓力、不良生活習慣等相關，其中三叉神經血管系統的激活是在眾多偏頭痛發病機制研究中占主導地位[3,12]。三叉神經血管系統激活后，三叉神經末梢釋放出多種具有促炎、血管活性及致痛作用的神經遞質，導致偏頭痛的發生和進展[12]。NF-κB是炎性過程中的關鍵轉錄因子，主要調控早期炎癥反應的信號通路，其靶基因主要位于腦血管內皮細胞、神經細胞和膠質細胞等[4,13]。Galeotti等[14]研究發現，硝酸甘油誘導的偏頭痛大鼠三叉神經尾核神經元內NF-κB被激活，而活化的NF-κB可促進IL-1β等炎癥細胞因子釋放，引起神經源性炎癥，誘導三叉神經致敏，導致偏頭痛發生。COX-2是一種誘導酶，在組織損傷、炎癥等情況下表達增強[15]。Nagy-Grocz等[16]研究發現COX-2被NF-κB調控，在偏頭痛發作時介導神經源性炎癥反應，并上調痛覺敏感性。CGRP是一種三叉神經節神經元異常合成并釋放的具有致痛作用的神經遞質，可以引發顱內、外血管擴張，促進神經源性炎性反應發生，在偏頭痛的發生中扮演重要角色[7,17]。同時研究發現CGRP的釋放是由依賴COX-2活性的PGE2誘導的。姚剛等[18]研究發現，大鼠皮下注射硝酸甘油可以激活大鼠的三叉神經血管系統，上調大鼠三叉神經節神經元CGRP的基因表達。本研究采用皮下注射硝酸甘油制備偏頭痛大鼠模型，結果發現偏頭痛大鼠均出現雙耳發紅及撓頭、爬籠次數增多的現象，提示模型建立成功。同時在偏頭痛大鼠三叉神經節內NF-κB p65、炎性因子IL-1β、炎性介質COX-2及致痛神經遞質CGRP的表達水平明顯增加，進一步證實NF-κB p65、IL-1β、COX-2及CGRP與偏頭痛的發生有關，與以往的研究結論一致。

ISO是臨床上常用的吸入性麻醉劑，其作用靶點廣泛分布于大腦皮質、腦干和脊髓等中樞神經系統。近年研究顯示適量ISO對于腦缺血再灌注損傷、腦缺氧性損傷、蛛網膜下腔出血等多種中樞神經系統急性損傷具有良好的神經保護作用，其保護機制與抗凋亡、抗炎等作用有關[8,9,19,]。呂慧敏等[8]研究表明，ISO對創傷性腦損傷有良好的神經保護作用，其機制與上調P13K/Akt的活性相關；Wang等[20]研究表明ISO可通過抑制p38MAPK/NF-κB信號通路，降低小鼠Kupffer細胞內的炎癥反應；Zhang等[21]研究表明ISO可通過抑制COX2的活性，減少CGRP的釋放，改善神經病理性疼痛。本研究結果顯示，ISO預處理能縮短偏頭痛大鼠耳紅消失的時間，降低撓頭、爬籠次數，抑制三叉神經節內胞核NF-κB p65蛋白及胞漿IL-1β、COX-2、CGRP蛋白的表達水平，說明ISO預處理能改善偏頭痛大鼠的行為學癥狀，其作用機制可能與抑制NF-κB的激活，降低炎性因子IL-1β、炎性介質COX-2以及致痛神經遞質CGRP的釋放有關。同時H組的效果明顯優于L組，提示ISO的使用劑量對偏頭痛的改善效果有影響，但最佳劑量仍需要進一步的研究才能得出準確結論。

綜上所述，異氟烷能改善偏頭痛大鼠的行為學癥狀，抑制偏頭痛發作時三叉神經血管系統激活后引起的神經炎癥反應，其機制可能與下調三叉神經節內IL-1β、COX-2及CGRP蛋白的表達水平，抑制NF-κB的激活有關。