Akt/mTOR信號通路在氨甲酰促紅細胞生成素促進腦梗死后神經發生作用的研究

李 洋，閆保君

腦梗死是最常見的腦卒中類型(約占80%)，具有高病死率、高致殘率、高復發率的特點。已有研究顯示，哺乳動物大腦室管膜下區(subventricular zone,SVZ)的神經干細胞(neural stem cells,NSCs)在生理情況下處于相對靜息狀態，但在腦梗死后被激活，不斷增殖分化為新生神經元，遷移至梗死灶附近，分化為成熟神經元修復受損腦組織[1]，提示SVZ神經發生或許是治療腦梗死的關鍵靶點。

促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)可促進腦梗死后神經功能恢復，但其存在增高血液黏滯度，誘發血栓等副作用。氨甲酰促紅細胞生成素 (carbamylated erythropoietin,CEPO)是無生血功能的EPO衍生物，無誘發血栓生成等副作用，且具有和EPO相近的神經保護作用。已有文獻證實，CEPO可促進腦梗死后SVZ內NSCs增殖[2]，但具體機制尚不明確。Akt/mTOR信號通路在中樞神經系統內，與神經元、膠質細胞增殖及突觸可塑性的調控密切相關。腫瘤學研究表明，CEPO與其受體結合后激活Akt/mTOR信號通路，促進結腸癌細胞增殖[3]。

本研究擬探討Akt/mTOR信號通路在CEPO促進腦梗死后神經發生作用的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 CEPO(Warren Pharmaceuticals，美國)；GSK2141795(Aktx阻斷劑，MCE，美國)；5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU,Sigma-Aldrich，美國)；小鼠抗小鼠nestin抗體 (abcam,美國)；兔抗小鼠BrdU抗體(abcam，美國)；兔抗小鼠p-Akt抗體(abcam，美國)；兔抗小鼠p-mTOR抗體(abcam，美國)； Alexa Fluor?488標記的山羊抗小鼠二抗(abcam，美國)；Alexa Fluor?555標記的驢抗兔二抗(abcam，美國)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(proteintech，美國)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(proteintech，美國)。

1.2 實驗動物 成年雄性C57BL/6小鼠85只，體重25～30 g，12～14 w齡。根據完全隨機數字表法分為4組：Sham組(18只)、大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)組(23只)、CEPO組(20只)和GSK組(24只)。自模型成功后，CEPO組和GSK組小鼠每天接受CEPO腹腔注射一次，劑量為8000 IU/kg，連續7 d；將GSK2141795溶于DMSO，再用生理鹽水稀釋，劑量為10 μg/g，GSK組小鼠自模型成功后隔天接受灌胃一次，連續7 d[4]。給予Sham組和MCAO組等量生理鹽水。在避光條件下，將BrdU粉末溶于生理鹽水，濃度為5 mg/ml。用于免疫熒光的小鼠于術后1 d開始，連續7 d腹腔注射劑量為50 mg/(kg·d)的BrdU溶液[5]。

1.3 MCAO模型的制備 應用改良線栓法制作小鼠右側MCAO模型。術前禁食禁水12 h，用5%水合氯醛(7.0 ml/kg)腹腔注射麻醉后，取仰臥位固定。小鼠頸部備皮、消毒后，取正中切口，分離右側頸總、頸外及頸內動脈。在距頸總動脈分叉約2 mm處剪一小口，插入線栓至大腦中動脈起始端，輕柔推進8～10 mm，結扎縫合。栓塞1 h后，緩慢拔出線栓約10 mm，剪去體外線栓。MCAO組、CEPO組和GSK組小鼠均按上述方法制作MCAO模型。Sham組小鼠將線栓插入至大腦中動脈起始端后迅速拔出，其余操作同以上3組。

1.4 神經功能評定 參照改良神經功能評分法(modified Neurological Severity Scores,mNSS)[6]，分別在小鼠造模后第1、7、14、28天進行神經功能評價。從運動、感覺、平衡、反射4個方面對神經功能進行綜合評估，評分12～16分的小鼠進入實驗。評分越高神經功能損害越嚴重，0分，無神經損傷癥狀；1分，有神經功能損害；2分，神經功能損害最嚴重。

1.5 免疫熒光 每組隨機抽取6只小鼠，取腦組織進行免疫熒光檢測。把BrdU作為細胞增殖標記物，nestin作為神經干細胞標記物。用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)和4%多聚甲醛溶液灌注、固定各組小鼠，取腦后將其放入4%多聚甲醛溶液中過夜固定。然后分別置于10%、30%蔗糖溶液脫水至腦組織沉底。冰凍后切成20 μm厚的腦片，PBS中漂洗后，放入0.25%Triton X-100溶液打孔30 min。1%BSA溶液封閉30 min后，4 ℃孵育一抗過夜：兔抗小鼠BrdU抗體(1∶600)，小鼠抗小鼠nestin抗體(1∶200)。PBS漂洗腦片3×10 min后，在室溫下孵育555標記的驢抗兔二抗(1∶400)和488標記的山羊抗小鼠二抗(1∶400)1 h，再用PBS漂洗，在400倍熒光顯微鏡下觀察、拍照[7]。分別隨機選取SVZ 3個不重疊視野，每只小鼠至少選擇3張腦片。應用Image J(NIH)圖像分析軟件計算每組SVZ增殖NSCs數。

1.6 Western blot 每組隨機抽取6只小鼠，在第7天用Western blot技術檢測各組小鼠SVZ中p-Akt和p-mTOR的表達量。取小鼠梗死側SVZ組織，加入適量RIPA、PMSF和磷酸酶抑制劑。將組織置于冰上充分勻漿后離心15 min(4 ℃，14000 r/min)，取上清液測定總蛋白含量，分裝保存于-80 ℃。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。室溫下用5%BSA溶液封閉1 h后，加入兔抗小鼠p-Akt一抗(1∶600)，在4 ℃下孵育過夜。用TBST漂洗3×5 min，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h。洗滌5 min，把PVDF膜放入掃描儀內，采用ECL顯色，觀察、拍照，用Image J分析所獲取條帶灰度。甘油酸-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和p-mTOR一抗(1∶800)檢測步驟同上[8]。

2 結 果

2.1 神經功能評分 重復測量方差分析結果顯示，CEPO組小鼠mNSS分值整體下降情況明顯低于MCAO組和GSK組(P<0.05)；MCAO組和GSK組小鼠mNSS整體下降情況，差異無統計學意義(P>0.05)。單因素方差分析比較各組各個時間點差異(見表1)。

2.2 CEPO顯著促進小鼠SVZ內NSCs增殖 免疫熒光結果顯示，術后7 d，MCAO組小鼠SVZ中BrdU+/Nestin+細胞數較Sham組顯著增多，且CEPO組BrdU+/Nestin+細胞數較MCAO組和GSK組明顯增多，差異具有統計學意義(P<0.05)(見圖1、表2)。

2.3 CEPO通過激活Akt/mTOR信號通路促進SVZ中NSCs增殖 術后7 d，MCAO組p-Akt和p-mTOR表達量較Sham組明顯增加，CEPO組的表達量較MCAO組明顯增加，GSK組的表達量較CEPO組顯著減少，差異具有統計學意義(P<0.05)(見圖2、表3)。

表1 各組小鼠mNSS差異(分,

與CEPO組比較*P<0.05；Sham組小鼠mNSS評分為0

表2 各組小鼠SVZ中BrdU+/Nestin+細胞(個,

與Sham組比較*P<0.05；與CEPO組比較#P<0.05

表3 各組小鼠SVZ中各蛋白光密度

與Sham組比較*P<0.05；與CEPO組比較#P<0.05

圖1 各組小鼠SVZ中BrdU+/Nestin+細胞(免疫熒光，×400)

圖2 各組小鼠SVZ中p-Akt和p-mTOR表達量

3 討 論

國內外研究證實，腦梗死后SVZ神經發生處于激活狀態，促進神經發生可改善腦梗死病情，人為抑制神經發生會加劇神經功能損傷[9]。成年哺乳動物腦SVZ內神經發生持續終生，在腦部創傷、脊髓損傷、腦組織缺血、腦出血等病理條件下，SVZ神經發生激活，能夠自我更新、存在高度分化潛能的內源性NSCs生成大量的新生神經元，后者沿血管網定向遷移至梗死區，通過參與免疫調節、局部血管新生并分化為成熟神經元替代或修復神經損傷。

EPO通過與造血相關組織中EPO受體(EPOR)結合刺激紅細胞增殖、分化與成熟。近來研究表明，EPOR在許多細胞中均有表達，包括神經元、膠質細胞和血管內皮細胞，EPO可通過促進血管發生、抑制炎癥反應、抑制NO的合成、阻斷谷氨酸興奮毒性、抗氧化反應和細胞凋亡、增強神經突觸信號傳遞、調節神經干細胞的增殖與分化等途徑在缺血性腦血管疾病中發揮重要保護作用，改善腦梗死后神經功能預后[10]。盡管如此，由于EPO促進紅細胞生成，存在易導致紅細胞增多癥，增高血液黏滯度，改變血流動力學而誘發形成血栓等副作用，從而限制了EPO在腦梗死等疾病的臨床運用。EPO中的賴氨酸通過氨甲酰化反應轉換為高瓜氨酸而形成CEPO，后者是無生血功能的EPO衍生物，不與經典的EPOR結合，不刺激骨髓造血系統，無促紅細胞生成和誘發血栓等副作用，且具有和EPO相近的神經保護作用。CEPO作為一種神經保護劑，可促進腦梗死后SVZ內NSCs增殖，但其具體機制尚不明確。

Akt/mTOR是公認的細胞內經典信號途徑，參與細胞增殖、分化及凋亡等多種功能的調節。在中樞神經系統中，Akt/mTOR信號通路與神經元、膠質細胞的增殖分化、突觸的重塑、神經遞質的信號傳遞、氧化應激以及自噬、凋亡的調控密切相關，在神經生理病理過程中發揮關鍵作用[11]。Akt/mTOR信號通路在受到外部刺激因素后被激活，Akt活化后，mTOR隨之被激活，通過調節其下游的p70S6K和4EBP1管理基因編碼和蛋白合成介導神經細胞增殖、發育分化、軸突再生、髓鞘形成以及突觸重塑。本研究結果表明，腦梗死后上調了SVZ內Akt信號通路，mTOR表達量升高，SVZ神經發生比正常生理狀態有所增強。使用CEPO后SVZ中Akt和mTOR表達量進一步升高，NSCs增殖增強，促進腦梗死后神經功能恢復。而應用Akt選擇性阻斷劑GSK2141795，抑制了Akt表達，并伴隨有mTOR表達量的下降，抵消了CEPO對腦梗死的神經功能恢復作用。證明了腦梗死后CEPO可能通過Akt/mTOR信號通路，產生促進SVZ內NSCs增殖的效應，進而改善神經功能。本研究探索了CEPO對腦梗死后SVZ內NSCs增殖的具體機制，為找到促進腦梗死后神經發生的潛在靶點提供了重要依據。