羅格列酮保護氧糖剝奪復氧PC12細胞通過減少HMGB1釋放和上調DUSP8

王 莉，張美杰，李文靜，毛森林，劉美玲，黃 山，蔡靈鈺，俞春江

研究證實PPARγ受體激動劑在腦缺血再灌注損傷、帕金森病和肌萎縮側索硬化等模型中減少神經元凋亡[1～5]，但PPARγ在缺血性腦損傷的具體機制尚不明確。炎性細胞分泌HMGB1，在腦缺血再灌注損傷中具有啟動與放大免疫反應的作用，PPARγ受體激動劑可減少HMGB1釋放[6]。近年報道PPARγ抗凋亡可能與雙特異性蛋白磷酸酶有關[7]。研究表明MAPK信號通路參與腦缺血再灌注后細胞凋亡，雙特異性蛋白磷酸酶使MAPK通路重要成員去磷酸化，發揮抗凋亡作用[7]。因此，我們推測PPARγ受體激動劑可能減少HMGB1分泌，并上調雙特異性蛋白磷酸酶8，發揮神經保護作用。本研究采用氧葡萄糖剝奪/復氧PC12細胞模型，觀察羅格列酮干預后的PPARγ、RAGE、HMGB1、DUSP8、Bcl-xl等指標變化，探討羅格列酮對缺血再灌注損傷神經細胞的保護作用及機制。

1 材料和方法

1.1 細胞培養及分組 PC12細胞接種在含10%胎牛血清的1640培養基中，置于5% CO237 ℃溫箱培養。培養液每2 d更換一次，待細胞覆蓋培養瓶壁70%～80%，按照1∶4的比例傳代。分組：(1)正常對照組：正常培養的PC12細胞；(2)溶劑對照組(vehicle 組)： 含0.1%DMSO的培養液處理的PC12細胞；(3)OGD10 h/R24 h組：PC12細胞氧葡萄糖剝奪10 h/復氧24 h；(4)OGD10 h/R24 h+RGZ組：OGD10 h后復氧時給予RGZ作用于PC12細胞24 h；(5)OGD10 h/R24 h+RGZ+GW9662組：OGD10 h后復氧時給予RGZ和GW9662作用于PC12細胞24 h。每組設6個復孔。

1.2 主要試劑和儀器 大鼠HMGB1 ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)；多克隆兔抗鼠PPARγ 抗體(Santa Cruz公司)，多克隆兔源抗DUSP8抗體(ORIGENE公司，美國)；辣根酶標記山羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)；PPARγ 激動劑羅格列酮(rosiglitazone,RGZ)；PPARγ 拮抗劑 GW9662 均購自 Cayman Chemical 公司；全自動酶標儀(BIO-RAD 680，美國)；倒置相差顯微鏡(Nikon TS100，日本)。

1.3 OGD/R模型建立 將PC12細胞按照2×104/ml密度接種于96孔板，每孔加入培養液約100 μl，置5% CO2培養箱24 h。待細胞貼壁后，將對照組培養基更換為含糖Earle’s平衡鹽溶液繼續培養；用無糖Earle’s平衡鹽溶液替換實驗組的完全培養基，將實驗組放入37 ℃，含95% N2、5% CO2混合氣體的培養箱10 h后，將對照組和實驗組更換為完全培養基，再置于37 ℃、5% CO2培養箱中分別培養6 h、12 h、24 h以及48 h模擬不同的再灌注時間。

1.4 細胞存活率檢測 將PC12細胞接種在96孔板中，并通過四基甲偶氮唑藍(MTT)測定細胞活力。PC12細胞OGD10 h后分別復氧6 h、12 h、24 h、48 h后，在常規培養基中于37 ℃與MTT(100 μg/ml)一起溫育。4 h后洗滌細胞，然后加入100 μl二甲亞砜(DMSO)溶解。使用酶聯免疫吸附測定儀，在570 nm監測產物形成。

1.5 Western blot檢測PPARγ、RAGE和DUSP 8及 Bcl-xl蛋白表達水平 吸棄培養液，預冷PBS洗滌兩次，將細胞移入1 ml離心管，4 ℃下2000 rpm離心5 mim，棄上清，在離心沉淀的細胞碎片內加入150 μl細胞裂解液及1.5 μl蛋白酶抑制劑(PMSF)混勻后于冰上裂解30 min，4 ℃下12000 rpm離心30 min，取上清液移至EP管-80 ℃保存。以10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，半干電轉移法轉移至PVDF膜，室溫下封閉1 h，分別加入1∶500稀釋的單克隆兔抗鼠PPARγ一抗(美國Santa Cruz，sc-73554)；1∶500稀釋的多克隆兔抗鼠DUSP8一抗(ORIGENE公司，美國，TA322744)，4 ℃孵育過夜；分別加入1∶3000稀釋的辣根酶標記山羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司，ZB2301)，室溫孵育2 h?；瘜W發光法顯色，應用凝膠圖像處理系統分析目標條帶的分子量和凈光密度值。

1.6 ELISA法檢測HMGB1水平 取各組細胞上清液 40 μl，按照說明書步驟操作，在波長為 450 nm下測量標準孔、樣本孔的OD值，根據標準曲線計算HMGB1含量。

2 結 果

2.1 建立OGD/R細胞損傷模型 PC12細胞經缺氧低糖處理10 h后，經不同復氧時間6～48 h后，測定細胞存活率。PC12細胞缺氧低糖處理10 h后，其存活率隨再灌注時間延長而降低，細胞存活率依次為(82.63±2)%、(66.17±3.82)%、(25.04±3.48)%、(24.44±0.17)%，同對照組相比差異明顯(P<0.01)。OGD10 h/R48 h組同OGD10 h/R24 h組相比較，無顯著差異(P>0.05)，故選擇OGD10 h/R24 h作為適宜的細胞損傷模型(見圖1A)。

2.2 羅格列酮和GW9662在OGD/R細胞模型中對細胞存活率影響

2.2.1 不同濃度羅格列酮對OGD/R處理后細胞存活率影響 PC12細胞OGD10 h后，復氧時給予不同濃度羅格列酮(0～15 μmol)作用24 h，檢測細胞存活率。結果顯示vehicle組與羅格列酮5 μmol組細胞生存率分別為(99.07±0.4)%、(101.07±4.55)%，同RGZ 0 μmol組相比無顯著性差異(P>0.05)；羅格列酮10 μmol和15 μmol組，細胞存活率分別為(148.56±6.1)%、(135.35±2.46)%，兩組相比無顯著差異(P>0.05)；羅格列酮10 μmol和15 μmol組，同RGZ 0 μmol組相比，細胞存活率明顯上升，差異均顯著(P<0.01)(見圖1B)。

2.2.2 不同濃度GW9662對羅格列酮作用的OGD/R處理后PC12細胞存活率的影響 PC12細胞OGD10 h后，復氧時給予10 μmol羅格列酮與不同濃度GW9662(0～15 μmol)作用24 h，測定細胞存活率。結果顯示GW9662濃度為10 μmol、15 μmol時，細胞生存率下降至(42.36±1.43)% 和(31.08±1.08)%，同RGZ10 μmol/GW9662 0 μmol組相比較，差異明顯(P<0.01)。RGZ 10 μmol/GW9662 15 μmol組與RGZ 10 μmol/GW9662 10 μmol組比較，無顯著差異(P>0.05)(見圖1C)。

2.3 羅格列酮在OGD/R細胞模型中對PPARγ受體的影響 PC12細胞OGD10 h后，復氧時給予10 μmol羅格列酮與15 μmol GW9662作用24 h，觀察其對PPARγ蛋白的影響。結果顯示，同對照組相比，PC12細胞經過OGD10 h/R24 h處理后，PPARγ蛋白表達水平明顯下降(P<0.01)；同OGD10 h/R24 h組相比，羅格列酮治療組PPARγ蛋白表達水平上升(P<0.01)；而GW9662能夠下調羅格列酮引起的PPARγ蛋白表達上升，且同羅格列酮治療組相比較，GW9662組蛋白表達明顯下降(P< 0.01)(見圖2A)。

2.4 羅格列酮在OGD/R細胞模型中抗晚期炎癥反應的作用

2.4.1 羅格列酮在OGD/R細胞模型中對HMGB1影響 PC12細胞OGD10 h后，復氧時給予10 μmol羅格列酮與15 μmol GW9662作用24 h后，測定細胞HMGB1分泌量。結果顯示，同對照組相比，PC12細胞經過OGD10 h/R24 h處理后，HMGB1分泌量明顯上升(P<0.01)；羅格列酮組HMGB1分泌量下降55.9 %，差異顯著(P<0.01)，提示羅格列酮可以通過減少HMGB1而發揮抗炎效應。而加入GW9662后，HMGB1分泌量上升達59.8%，差異顯著(P<0.01)(見圖2B)。羅格列酮減少HMGB1釋放的效應，被GW9662所阻斷，提示其作用機制經由PPARγ受體介導。

2.4.2 羅格列酮在OGD/R細胞模型中對RAGE蛋白影響 PC12細胞OGD10 h后，復氧時給予10 μmol羅格列酮與15 μmol GW9662作用24 h后，檢測RAGE蛋白表達水平。結果顯示，OGD10 h/R24 h后，RAGE表達顯著增加，而經過羅格列酮處理后，RAGE表達明顯下調，但羅格列酮這種作用可被GW9662所阻斷，表現為GW9662處理組RAGE蛋白表達顯著增加 (P<0.01)(見圖2C)，提示其作用機制經由PPARγ受體介導。

2.5 羅格列酮在OGD/R細胞模型中抗凋亡作用

2.5.1 羅格列酮在OGD/R細胞模型中對DUSP8蛋白影響 PC12細胞OGD10 h后，復氧時給予10 μmol羅格列酮與15 μmol GW9662作用24 h后，檢測DUSP8表達情況。結果顯示，同對照組相比，OGD10 h/R24 h處理后，DUSP8表達水平明顯下降(P<0.01)；羅格列酮干預后DUSP8表達水平明顯上升(P<0.01)；而GW9662能夠下調DUSP8表達上升，表現為GW9662處理組DUSP蛋白表達顯著降低 (P<0.01)(見圖3A)，提示羅格列酮引起DUSP8蛋白上調是經由PPARγ受體介導的。

2.5.2 羅格列酮在OGD/R細胞模型中對Bcl-xl蛋白影響 PC12細胞OGD10 h后，復氧時給予10 μmol羅格列酮與15 μmol GW9662作用24 h后，檢測細胞Bcl-xl表達情況。結果顯示，同對照組比較，OGD10 h/R24 h處理后，Bcl-xl表達水平明顯下降 (P<0.01)；羅格列酮組Bcl-xl表達水平顯著上升(P<0.01)；而GW9662能夠下調羅格列酮引起的Bcl-xl表達上升，因此GW9662組的Bcl-xl表達明顯下降(P<0.01)(見圖3B)。說明羅格列酮引起的抗凋亡蛋白Bcl-xl上調是經由PPARγ受體介導的。

A：不同再灌注時間對PC12細胞存活率影響；B：不同濃度羅格列酮和0.1%DMSO對OGD10 h/R24 h的PC12細胞存活率影響；C：不同濃度GW9662對10 μmol羅格列酮作用后OGD10 h/R24 h的PC12細胞存活率影響。與control組相比**P<0.01；與RGZ 0 μmol組相比**P<0.01；與RGZ10 μmol/GW9662 0 μmol組相比◆◆P<0.01

圖1 不同再灌注時間以及不同濃度羅格列酮和GW9662對PC12細胞存活率影響

A：PPARγ蛋白表達；B：HMGB1蛋白分泌情況；C：RAGE蛋白表達。與對照組相比較##P<0.01;與OGD10 h/R24 h組相比較**P<0.01；與OGD10 h/R24 h+10 μmol RGZ組相比較■■P<0.01

圖2 羅格列酮10 μmol、GW9662 15 μmol對OGD10 h/R24 h的PC12細胞的PPARγ、HMGB1以及RAGE蛋白表達的影響

A：對DUSP蛋白表達影響；B：對Bcl-xl蛋白表達影響。與對照組相比較**P<0.01;與OGD10 h/R24 h組相比較##P<0.01；與OGD10 h/R24 h+10 μmol RGZ組相比較■■P<0.01

圖3 羅格列酮10 μmol與GW9662 15 μmol對OGD10 h/R24 h處理的PC12細胞的DUSP8和Bcl-xl蛋白表達影響

4 討 論

近年來對缺血性腦卒中研究熱點集中于缺血再灌注損傷的具體機制，已證實PPARγ激動劑能夠減輕缺血再灌注損傷、帕金森病及肌萎縮側索硬化等細胞模型的損傷，這為PPARγ激動劑用于治療腦組織缺血再灌注損傷提供了充分研究基礎[8,9]。

有研究報道羅格列酮可以減輕缺血后的炎癥反應，涉及IL-1、IL-6、TNF等炎性介質[10]，本研究進一步證實了羅格列酮可以通過減少HMGB1的釋放，而發揮減輕腦缺血再灌注后晚期炎癥反應的效果[11]。HMGB1是一種重要的晚期炎癥介質，可由細胞直接破壞釋放，也可以由免疫細胞分泌。在細胞遷移和炎性反應時，HMGB1是RAGE的生理性配體[12]。HMGB1/RAGE可通過激活核因子κB(NF-κB)促進炎性反應，進而誘導神經元凋亡[13]。研究報道PPARγ 激活可以調節HMGB1/RAGE信號通路，在急性肺損傷中發揮保護作用[14]。PPARγ是否可在神經細胞缺血再灌注損傷模型中，通過調節HMGB1/RAGE信號通路發揮保護作用，國內外缺乏相關報道。本研究發現羅格列酮使氧糖剝奪神經細胞RAGE表達下調，HMGB1分泌顯著下降，而PPARγ受體抑制劑GW9662可以逆轉該作用，提示羅格列酮通過PPARγ激活調控HMGB1分泌而發揮抗炎效應，并且可能通過調節HMGB1/RAGE信號通路發揮保護作用，但其具體機制值得深入研究。

蛋白激酶是近期研究較多的靶點，應激激活蛋白激酶(SAPK)包括c-Jun N末端蛋白激酶、p38絲裂原活化蛋白激酶，在腦缺血后被激活，抑制c-Jun N末端蛋白激酶或者p38絲裂原活化蛋白激酶，可以拮抗腦缺血后導致的細胞死亡[15～17]。近年來已有研究證實防止細胞凋亡是噻唑烷二酮類對于腦缺血損傷后神經保護的主要機制之一，羅格列酮通過下調含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶而減少細胞凋亡，其機制涉及JNK和p38激酶的磷酸化作用[7]。并且，相關研究集中探討蛋白質酪氨酸磷酸酶(DUSPs)對于蛋白激酶磷酸化作用的調控[7]。DUSP8可以特定作用于JNK和p38，有研究報道羅格列酮對腦缺血動物模型神經細胞死亡的保護作用，主要是通過促進DUSP8上調，從而阻止JNK磷酸化激活作用實現的[7]。

在本研究中，我們證實了使用羅格列酮作用于OGD/R神經細胞模型后， DUSP8蛋白和Bcl-xl表達均增加，而PPARγ受體抑制劑GW9662可以逆轉該作用。從而肯定了以羅格列酮為代表的PPARγ受體激動劑通過上調DUSP8和Bcl-xl，對缺血和再灌注模型中神經細胞的死亡起到保護作用。

綜上所述，我們證實了以羅格列酮為代表的PPARγ受體激動劑在神經細胞缺血和再灌注模型中可以通過減輕炎癥反應和上調DUSP8發揮抗凋亡作用，而羅格列酮保護神經元的作用可以被PPARγ受體抑制劑逆轉，進一步證實其作用機制是通過PPARγ受體激活實現的。但本研究尚缺乏對于JNK信號通道的檢測，若能證實DUSP8蛋白升高，直接導致JNK磷酸化程度降低，從而減少細胞凋亡，則對于PPARγ受體激動劑的神經元保護機制，將提供更有力證據支持。因此，對于PPARγ受體激動劑的神經元保護機制的具體步驟，如對JNK信號通道的檢測等，尚待深入探討。