河南不同地區(qū)赤霞珠葡萄表皮酵母菌多樣性研究

張俊杰，尚益民，陳錦永，程大偉，祁 帥，彭姍姍，劉崇懷

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 鄭州果樹研究所，河南 鄭州 450009；2.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

葡萄酒是以新鮮葡萄或葡萄汁為原料，經(jīng)過部分或全部發(fā)酵而成的一類酒飲料，可分為紅葡萄酒和白葡萄酒、桃紅葡萄酒3種[1-2]。其釀造過程的本質(zhì)是從葡萄收集、葡萄破碎成汁、葡萄酒一次、兩次發(fā)酵直到包裝、儲(chǔ)藏整個(gè)釀造過程中多種微生物的代謝過程[3]。葡萄酒的釀造離不開微生物（酵母菌、霉菌等）[4]，其中，酵母菌是葡萄酒釀造過程中的主要微生物[5]，其在發(fā)酵過程中對(duì)葡萄酒的品質(zhì)有重要的影響，且對(duì)葡萄酒的特色和風(fēng)格具有突出貢獻(xiàn)[6]。

我國的葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，但是關(guān)于葡萄酒酵母的研究與國內(nèi)葡萄酒產(chǎn)業(yè)規(guī)模之間的差距較大。目前，國內(nèi)大部分葡萄酒廠所用的酵母菌都是從國外引進(jìn)的商業(yè)酵母，此種酵母的大量使用，使得國內(nèi)本土酵母在釀造過程中失去主導(dǎo)地位，從而導(dǎo)致所生產(chǎn)出的葡萄酒風(fēng)格單一，體現(xiàn)不出產(chǎn)區(qū)特色[7-8]。因此，雖然有商業(yè)葡萄酒酵母可供使用，但產(chǎn)區(qū)酵母已經(jīng)適應(yīng)了當(dāng)?shù)氐奈⑸锃h(huán)境，易于在葡萄酒發(fā)酵中占主導(dǎo)地位，形成產(chǎn)區(qū)的典型特色，大部分葡萄酒生產(chǎn)商更傾向于選育葡萄產(chǎn)區(qū)酵母來生產(chǎn)具有產(chǎn)區(qū)特色的葡萄酒[9-10]。

傳統(tǒng)的酵母菌分類主要是參照《酵母菌的特征和鑒定手冊(cè)》[11]和《微生物分類學(xué)》[12]，該分類方法不僅工作量大、周期長、操作復(fù)雜且鑒定結(jié)果的重復(fù)性差[13]。而現(xiàn)代分子生物學(xué)鑒定法主要以核酸作為研究對(duì)象，研究的是基因型，能反映其遺傳本質(zhì)[14-16]，不僅鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確，而且縮短了鑒定時(shí)間[17]。

安陽、長垣、漯河分別位于河南的北部、中部以及南部，關(guān)于這3個(gè)地區(qū)的赤霞珠葡萄表皮酵母菌尚未有所研究。因此，本研究以安陽、長垣、漯河3個(gè)地區(qū)葡萄種植園的成熟赤霞珠葡萄表皮為原料，對(duì)表皮酵母菌進(jìn)行富集分離、鑒定及多樣性研究[18]。通過比較這3個(gè)地區(qū)赤霞珠葡萄表皮酵母菌的多樣性，可以有效地揭示不同地理位置對(duì)表皮酵母菌分布的影響，從而為不同地區(qū)選育合適釀酒酵母提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

赤霞珠葡萄原料：于2017年9月21～29日采自安陽、長垣及漯河的葡萄種植園，分別標(biāo)記為AY、CY、LH。采樣方法：每個(gè)地點(diǎn)選擇3個(gè)葡萄園，標(biāo)記為1、2、3，每個(gè)葡萄園隨機(jī)采集3串健康的葡萄，并在采集當(dāng)天置于冷凍盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，備用。

1.1.2 主要培養(yǎng)基及試劑

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基、YEPD瓊脂培養(yǎng)基和WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、Ezup柱式基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒、26S rDNA D1/D2區(qū)擴(kuò)增引物NL-1和NL-4、5.8S ITS區(qū)擴(kuò)增引物ITS-1和ITS-4：生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)：蘇州凈化安泰公司；DH-600生化培養(yǎng)箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；C1000聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀：美國BIO-RAD公司；JY02S紫外分析儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 赤霞珠葡萄表皮酵母菌的富集、分離及純化

參見賈春鳳等[19]的方法對(duì)赤霞珠葡萄表皮的酵母菌進(jìn)行富集、分離及純化。具體方法如下：在無菌條件下，用無菌生理鹽水洗滌赤霞珠葡萄表皮，并接種于YEPD培養(yǎng)基（含10μg/mg氯霉素）中，28℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h。隨后，對(duì)富集液進(jìn)行梯度稀釋（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6），選取稀釋度為10-3、10-4、10-5的稀釋液均勻涂布于YEPD瓊脂培養(yǎng)基，28℃條件下培養(yǎng)至長出單菌落，隨機(jī)從平板上挑取單菌落進(jìn)行純化和保藏。

1.3.2 分離酵母菌的形態(tài)觀察

挑取保藏在斜面上的酵母菌以三次劃線的方式接種至WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于28℃條件下培養(yǎng)5 d，對(duì)所有酵母菌的單菌落形態(tài)進(jìn)行觀察。根據(jù)WL培養(yǎng)基上的表型差異，對(duì)分離菌株進(jìn)行初步分類并從每個(gè)類型中隨機(jī)挑選代表菌。然后，采用40倍光學(xué)顯微鏡對(duì)代表菌株進(jìn)行顯微觀察。

1.3.3 代表酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

參照DNA提取按照試劑盒說明書提取代表菌株的DNA，以其為模板，使用正向引物NL1（5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）和反向引物NL4（5′-GGTCCCGTGTTTCAAGACGG-3′）PCR擴(kuò)增26S rDNA Dl/D2區(qū)基因序列。同理，使用正向引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和反向引物ITS4（5′-TCCTCCGCTATTGATATGC-3′）PCR擴(kuò)增5.8S ITS區(qū)基因序列。PCR擴(kuò)增體系及程序參照劉愛國[20]的方法。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳參數(shù)為100 V、30 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性搜索，選取同源性較高的菌株的26S rDNA Dl/D2和5.8S ITS區(qū)基因序列，采用MEGA 6軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[20]。

1.3.4 酵母菌不同種群數(shù)量分布

通過形態(tài)觀察和分子生物學(xué)鑒定確定了各個(gè)代表菌株所屬種群，采用Excel軟件統(tǒng)計(jì)不同地區(qū)的不同酵母菌種群分布情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霞珠葡萄表皮酵母菌的分離及純化

通過YEPD培養(yǎng)基的富集及YEPD瓊脂培養(yǎng)基的分離和純化，分別從安陽、長垣、漯河葡萄種植園的赤霞珠葡萄表皮分離純化到70、66和57株酵母菌，即共分離得到193株酵母菌株。

2.2 酵母菌的形態(tài)學(xué)及初步聚類分析

根據(jù)193株酵母菌在WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的表型特征，可分為10種不同表型（I～X），然后，對(duì)每個(gè)表型代表菌株的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖1及表1所示。由圖1可知，共得到4種顯微形態(tài)：檸檬形兩端出芽（表型Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅹ）、檸檬形單端出芽（表型Ⅲ）、橢圓形單端出芽（表型Ⅳ和Ⅶ）、梭形單端出芽（表型Ⅷ）。

圖1 各類型代表菌株在WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)（左）和細(xì)胞形態(tài)（右）Fig.1 Colonial morphology（left）and cell morphology（right）of different types of representative strains on WL nutrient agar medium

表1 各類型代表酵母菌基于WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的表型聚類分析結(jié)果Table 1 Phenotypes clustering analysis results of different types of representative yeasts on WL nutrient agar medium

2.2 酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

2.2.1 代表菌株26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析

從10類菌株中挑選14株代表菌株AY1-3、AY1-16、AY1-22、AY3-2、AY3-11、CY1-7、CY2-23、CY3-8、LH1-5、LH1-7、LH2-9、LH3-4、LH3-17和LH3-19，對(duì)14株代表菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物堿基長度約為600 bp。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果提交至NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST搜索，選取同源性高的序列，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值設(shè)為1 000，結(jié)果見圖2。

圖2 基于26S rDNA D1/D2區(qū)序列代表菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of representative strains based on 26S rDNA D1/D2 region sequences

由圖2可知，代表菌株CY1-7和LH1-7分別屬于類型Ⅹ和類型Ⅰ，但卻都與葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）聚為同一分支，兩種類型的菌株均被鑒定為H.u varum；代表菌株LH1-5屬于類型Ⅸ，與葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）聚于同一分支，且序列相似性為100%，被鑒定為H.vineae；而代表菌株CY2-23和AY3-2同屬于類型Ⅷ，且都與橡樹假絲酵母（Candida quercitrusa）聚為同一分支，被鑒定為C.quercitrusa；代表菌株AY1-3屬于類型Ⅵ，菌株AY1-16和CY3-8屬于類型Ⅳ，但均與陸生伊薩酵母（Issatchenkia terricola）聚于同一分支，序列相似性為100%，被鑒定為I.terricola；代表菌株LH2-9屬于類型Ⅶ，與Pichia terricola聚為同一分支，且序列相似性為100%，被鑒定為P.terricola。然而代表菌株AY1-22、AY3-11和LH3-4、17、19與Hanseniaspora guillemondii和仙人掌有孢漢遜酵母（Hanseniaspora opuntiae）共聚為同一分支，因此，僅依靠26SrDNA D1/D2序列分析結(jié)果不能將這些菌株準(zhǔn)確地鑒定到種水平，故對(duì)這些菌株進(jìn)行5.8SITS序列測序分析。

2.2.2 代表菌株5.8S ITS序列分析

代表菌株AY1-22、AY3-11和LH3-4、17、19的5.8S ITS序列在NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST搜索，結(jié)果如表2。選取同源性較高的模式菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

表2 代表菌株與已知菌株的5.8S ITS序列相似性Table 2 5.8S ITS sequences similarity between representative strains and known strains

由表2及圖3可知，5株代表菌株均與H.opuntiae的序列相似性＞99%，因此，被確定為H.opuntiae。這幾株菌是類型Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ的代表菌株，因此，類型Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ的菌株可以被確定為H.opuntiae。

圖3 基于5.8S ITS區(qū)序列代表菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of representative strains based on 5.8S ITS region sequences

結(jié)合形態(tài)觀察、26S rDNA D1/D2和5.8S ITS測序結(jié)果得出，193株菌株為4個(gè)屬的6個(gè)種群。類型Ⅰ和類型Ⅹ的菌株都可以被鑒定為H.uvarum；類型Ⅱ、類型Ⅲ和類型Ⅴ的菌株都可以被鑒定為H.opuntiae；類型Ⅳ和類型Ⅵ的菌株都可被確定為I.terricola；類型Ⅶ的菌株被鑒定為P.terricola；類型Ⅷ的菌株為C.quercitrusa；類型Ⅸ的菌株為H.vineae。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）廣泛存在于葡萄表皮，但是本次實(shí)驗(yàn)卻完全未分離出，分析原因可能是由于該種群的數(shù)量較少，且本研究中分離總菌株數(shù)目較少；本研究未統(tǒng)計(jì)WL營養(yǎng)瓊脂上表型為單一菌株的相關(guān)酵母；該種群可能不是這些研究地區(qū)葡萄表皮的主要酵母類群。

2.3 酵母菌不同種群的分布

各個(gè)地點(diǎn)的不同種群菌株數(shù)量分布如圖4所示。由圖4可知，安陽地區(qū)的主要酵母菌是H.opuntiae和H.uvarum，且H.opuntiae菌株數(shù)最多，為41株；長垣地區(qū)的主要酵母菌為I.terricola；而漯河地區(qū)的酵母菌種類最多，不同種群的酵母菌株數(shù)量均＞10株，但是漯河地區(qū)未發(fā)現(xiàn)酵母種群C.quercitrusa，其只在安陽和長垣地區(qū)發(fā)現(xiàn)，且數(shù)量極少。

圖4 不同種群酵母菌的分布Fig.4 Distribution of yeasts of different species

3 結(jié)論

該研究研究河南省內(nèi)不同地區(qū)赤霞珠葡萄表皮酵母菌的多樣性，從3個(gè)地區(qū)的成熟葡萄表皮共分離得到193株酵母菌，根據(jù)形態(tài)觀察，分為10個(gè)表型；在此基礎(chǔ)上，根據(jù)26S rDNA D1/D2區(qū)序列和5.8S ITS序列分析，酵母菌被鑒定為4個(gè)屬6個(gè)種，分別為H.opuntiae、H.uvarum、I.terricola、C.quercitrusa、H.vineae和P.terricola。其中H.opuntiae和H.uvarum分布于3個(gè)地區(qū)，且數(shù)量較多，即這兩個(gè)種群的酵母菌分布范圍廣；而P.terricola和H.vineae僅分布于漯河地區(qū)，但漯河地區(qū)未發(fā)現(xiàn)I.terricola和C.quercitrusa；C.quercitrusa僅分布于安陽和長垣地區(qū)，且數(shù)量極少。因此，不同地區(qū)的酵母菌種類及數(shù)目上的分布存在一定的差異。