河南不同地區赤霞珠葡萄表皮酵母菌多樣性研究

張俊杰，尚益民，陳錦永，程大偉，祁 帥，彭姍姍，劉崇懷

（1.中國農業科學院 鄭州果樹研究所，河南 鄭州 450009；2.鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002）

葡萄酒是以新鮮葡萄或葡萄汁為原料，經過部分或全部發酵而成的一類酒飲料，可分為紅葡萄酒和白葡萄酒、桃紅葡萄酒3種[1-2]。其釀造過程的本質是從葡萄收集、葡萄破碎成汁、葡萄酒一次、兩次發酵直到包裝、儲藏整個釀造過程中多種微生物的代謝過程[3]。葡萄酒的釀造離不開微生物（酵母菌、霉菌等）[4]，其中，酵母菌是葡萄酒釀造過程中的主要微生物[5]，其在發酵過程中對葡萄酒的品質有重要的影響，且對葡萄酒的特色和風格具有突出貢獻[6]。

我國的葡萄酒產業發展迅速，但是關于葡萄酒酵母的研究與國內葡萄酒產業規模之間的差距較大。目前，國內大部分葡萄酒廠所用的酵母菌都是從國外引進的商業酵母，此種酵母的大量使用，使得國內本土酵母在釀造過程中失去主導地位，從而導致所生產出的葡萄酒風格單一，體現不出產區特色[7-8]。因此，雖然有商業葡萄酒酵母可供使用，但產區酵母已經適應了當地的微生物環境，易于在葡萄酒發酵中占主導地位，形成產區的典型特色，大部分葡萄酒生產商更傾向于選育葡萄產區酵母來生產具有產區特色的葡萄酒[9-10]。

傳統的酵母菌分類主要是參照《酵母菌的特征和鑒定手冊》[11]和《微生物分類學》[12]，該分類方法不僅工作量大、周期長、操作復雜且鑒定結果的重復性差[13]。而現代分子生物學鑒定法主要以核酸作為研究對象，研究的是基因型，能反映其遺傳本質[14-16]，不僅鑒定結果更準確，而且縮短了鑒定時間[17]。

安陽、長垣、漯河分別位于河南的北部、中部以及南部，關于這3個地區的赤霞珠葡萄表皮酵母菌尚未有所研究。因此，本研究以安陽、長垣、漯河3個地區葡萄種植園的成熟赤霞珠葡萄表皮為原料，對表皮酵母菌進行富集分離、鑒定及多樣性研究[18]。通過比較這3個地區赤霞珠葡萄表皮酵母菌的多樣性，可以有效地揭示不同地理位置對表皮酵母菌分布的影響，從而為不同地區選育合適釀酒酵母提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

赤霞珠葡萄原料：于2017年9月21～29日采自安陽、長垣及漯河的葡萄種植園，分別標記為AY、CY、LH。采樣方法：每個地點選擇3個葡萄園，標記為1、2、3，每個葡萄園隨機采集3串健康的葡萄，并在采集當天置于冷凍盒中運回實驗室，備用。

1.1.2 主要培養基及試劑

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基、YEPD瓊脂培養基和WL營養瓊脂培養基、Ezup柱式基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒、26S rDNA D1/D2區擴增引物NL-1和NL-4、5.8S ITS區擴增引物ITS-1和ITS-4：生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化安泰公司；DH-600生化培養箱：北京中興偉業儀器有限公司；TGL-16G臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；C1000聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：美國BIO-RAD公司；JY02S紫外分析儀：北京君意東方電泳設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 赤霞珠葡萄表皮酵母菌的富集、分離及純化

參見賈春鳳等[19]的方法對赤霞珠葡萄表皮的酵母菌進行富集、分離及純化。具體方法如下：在無菌條件下，用無菌生理鹽水洗滌赤霞珠葡萄表皮，并接種于YEPD培養基（含10μg/mg氯霉素）中，28℃、180 r/min條件下振蕩培養48 h。隨后，對富集液進行梯度稀釋（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6），選取稀釋度為10-3、10-4、10-5的稀釋液均勻涂布于YEPD瓊脂培養基，28℃條件下培養至長出單菌落，隨機從平板上挑取單菌落進行純化和保藏。

1.3.2 分離酵母菌的形態觀察

挑取保藏在斜面上的酵母菌以三次劃線的方式接種至WL營養瓊脂培養基，于28℃條件下培養5 d，對所有酵母菌的單菌落形態進行觀察。根據WL培養基上的表型差異，對分離菌株進行初步分類并從每個類型中隨機挑選代表菌。然后，采用40倍光學顯微鏡對代表菌株進行顯微觀察。

1.3.3 代表酵母菌的分子生物學鑒定

參照DNA提取按照試劑盒說明書提取代表菌株的DNA，以其為模板，使用正向引物NL1（5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）和反向引物NL4（5′-GGTCCCGTGTTTCAAGACGG-3′）PCR擴增26S rDNA Dl/D2區基因序列。同理，使用正向引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和反向引物ITS4（5′-TCCTCCGCTATTGATATGC-3′）PCR擴增5.8S ITS區基因序列。PCR擴增體系及程序參照劉愛國[20]的方法。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，電泳參數為100 V、30 min。

PCR擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的Genbank數據庫中進行BLAST同源性搜索，選取同源性較高的菌株的26S rDNA Dl/D2和5.8S ITS區基因序列，采用MEGA 6軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹[20]。

1.3.4 酵母菌不同種群數量分布

通過形態觀察和分子生物學鑒定確定了各個代表菌株所屬種群，采用Excel軟件統計不同地區的不同酵母菌種群分布情況。

2 結果與分析

2.1 赤霞珠葡萄表皮酵母菌的分離及純化

通過YEPD培養基的富集及YEPD瓊脂培養基的分離和純化，分別從安陽、長垣、漯河葡萄種植園的赤霞珠葡萄表皮分離純化到70、66和57株酵母菌，即共分離得到193株酵母菌株。

2.2 酵母菌的形態學及初步聚類分析

根據193株酵母菌在WL營養瓊脂培養基上的表型特征，可分為10種不同表型（I～X），然后，對每個表型代表菌株的細胞形態進行觀察，結果如圖1及表1所示。由圖1可知，共得到4種顯微形態：檸檬形兩端出芽（表型Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅹ）、檸檬形單端出芽（表型Ⅲ）、橢圓形單端出芽（表型Ⅳ和Ⅶ）、梭形單端出芽（表型Ⅷ）。

圖1 各類型代表菌株在WL營養瓊脂培養基上的菌落形態（左）和細胞形態（右）Fig.1 Colonial morphology（left）and cell morphology（right）of different types of representative strains on WL nutrient agar medium

表1 各類型代表酵母菌基于WL營養瓊脂培養基的表型聚類分析結果Table 1 Phenotypes clustering analysis results of different types of representative yeasts on WL nutrient agar medium

2.2 酵母菌的分子生物學鑒定

2.2.1 代表菌株26S rDNA D1/D2區序列分析

從10類菌株中挑選14株代表菌株AY1-3、AY1-16、AY1-22、AY3-2、AY3-11、CY1-7、CY2-23、CY3-8、LH1-5、LH1-7、LH2-9、LH3-4、LH3-17和LH3-19，對14株代表菌株的26S rDNA D1/D2區序列進行PCR擴增，PCR擴增產物堿基長度約為600 bp。將PCR擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果提交至NCBI的Genbank數據庫中進行BLAST搜索，選取同源性高的序列，采用NJ法構建系統發育樹，自展值設為1 000，結果見圖2。

圖2 基于26S rDNA D1/D2區序列代表菌株的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of representative strains based on 26S rDNA D1/D2 region sequences

由圖2可知，代表菌株CY1-7和LH1-7分別屬于類型Ⅹ和類型Ⅰ，但卻都與葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）聚為同一分支，兩種類型的菌株均被鑒定為H.u varum；代表菌株LH1-5屬于類型Ⅸ，與葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）聚于同一分支，且序列相似性為100%，被鑒定為H.vineae；而代表菌株CY2-23和AY3-2同屬于類型Ⅷ，且都與橡樹假絲酵母（Candida quercitrusa）聚為同一分支，被鑒定為C.quercitrusa；代表菌株AY1-3屬于類型Ⅵ，菌株AY1-16和CY3-8屬于類型Ⅳ，但均與陸生伊薩酵母（Issatchenkia terricola）聚于同一分支，序列相似性為100%，被鑒定為I.terricola；代表菌株LH2-9屬于類型Ⅶ，與Pichia terricola聚為同一分支，且序列相似性為100%，被鑒定為P.terricola。然而代表菌株AY1-22、AY3-11和LH3-4、17、19與Hanseniaspora guillemondii和仙人掌有孢漢遜酵母（Hanseniaspora opuntiae）共聚為同一分支，因此，僅依靠26SrDNA D1/D2序列分析結果不能將這些菌株準確地鑒定到種水平，故對這些菌株進行5.8SITS序列測序分析。

2.2.2 代表菌株5.8S ITS序列分析

代表菌株AY1-22、AY3-11和LH3-4、17、19的5.8S ITS序列在NCBI的Genbank數據庫中進行BLAST搜索，結果如表2。選取同源性較高的模式菌株構建系統發育樹，結果見圖3。

表2 代表菌株與已知菌株的5.8S ITS序列相似性Table 2 5.8S ITS sequences similarity between representative strains and known strains

由表2及圖3可知，5株代表菌株均與H.opuntiae的序列相似性＞99%，因此，被確定為H.opuntiae。這幾株菌是類型Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ的代表菌株，因此，類型Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ的菌株可以被確定為H.opuntiae。

圖3 基于5.8S ITS區序列代表菌株的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of representative strains based on 5.8S ITS region sequences

結合形態觀察、26S rDNA D1/D2和5.8S ITS測序結果得出，193株菌株為4個屬的6個種群。類型Ⅰ和類型Ⅹ的菌株都可以被鑒定為H.uvarum；類型Ⅱ、類型Ⅲ和類型Ⅴ的菌株都可以被鑒定為H.opuntiae；類型Ⅳ和類型Ⅵ的菌株都可被確定為I.terricola；類型Ⅶ的菌株被鑒定為P.terricola；類型Ⅷ的菌株為C.quercitrusa；類型Ⅸ的菌株為H.vineae。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）廣泛存在于葡萄表皮，但是本次實驗卻完全未分離出，分析原因可能是由于該種群的數量較少，且本研究中分離總菌株數目較少；本研究未統計WL營養瓊脂上表型為單一菌株的相關酵母；該種群可能不是這些研究地區葡萄表皮的主要酵母類群。

2.3 酵母菌不同種群的分布

各個地點的不同種群菌株數量分布如圖4所示。由圖4可知，安陽地區的主要酵母菌是H.opuntiae和H.uvarum，且H.opuntiae菌株數最多，為41株；長垣地區的主要酵母菌為I.terricola；而漯河地區的酵母菌種類最多，不同種群的酵母菌株數量均＞10株，但是漯河地區未發現酵母種群C.quercitrusa，其只在安陽和長垣地區發現，且數量極少。

圖4 不同種群酵母菌的分布Fig.4 Distribution of yeasts of different species

3 結論

該研究研究河南省內不同地區赤霞珠葡萄表皮酵母菌的多樣性，從3個地區的成熟葡萄表皮共分離得到193株酵母菌，根據形態觀察，分為10個表型；在此基礎上，根據26S rDNA D1/D2區序列和5.8S ITS序列分析，酵母菌被鑒定為4個屬6個種，分別為H.opuntiae、H.uvarum、I.terricola、C.quercitrusa、H.vineae和P.terricola。其中H.opuntiae和H.uvarum分布于3個地區，且數量較多，即這兩個種群的酵母菌分布范圍廣；而P.terricola和H.vineae僅分布于漯河地區，但漯河地區未發現I.terricola和C.quercitrusa；C.quercitrusa僅分布于安陽和長垣地區，且數量極少。因此，不同地區的酵母菌種類及數目上的分布存在一定的差異。