中溫大曲在發酵和貯存過程中微生物群落結構分析

唐賢華，田 偉，張崇軍，周 文，舒學香

（1.四川工商職業技術學院，四川 都江堰 611830；2.中國測試技術研究院，四川 成都 610021）

我國傳統白酒的釀造是依靠大曲中菌系的繁殖代謝而進行的[1]。參與釀酒發酵的微生物種類很多，包括細菌、霉菌、酵母菌等。追蹤其來源，主要是大曲發酵過程中網羅自然界的微生物，因而通過研究大曲中的微生物，了解大曲中微生物數量、種類和分布規律，從而明白白酒的發酵原理是很有必要的[2-5]。中溫大曲是清香型大曲酒的糖化發酵劑，由于其發酵最高品溫一般在50℃以下，故稱中溫大曲。

大曲的質量與培養、貯存過程有著密切的關系，主要體現在微生物的差異上，不同時期曲坯的微生物結構和數量有顯著區別，影響著糖化酶、液化酶和蛋白酶等多種酶類以及有機酸等代謝產物的生成[6]。目前學者關于不同時期大曲研究中，蘇暢等[7]對不同時期大曲中分離的霉菌采用ITS4/5 rRNA區序列進行分析比對，共分離鑒定了193株霉菌，分屬于13個種，初步探究出大曲生產過程中不同時期霉菌的組成和變化規律。張麗等[8]對醬香型大曲貯存過程中發酵性能變化進行了研究，得到了高溫大曲的最佳貯存期，為穩定基酒的產量和質量提供了參考。王玉霞等[9]對濃香型白酒大曲在發酵和成熟過程中主要功能酶活力進行了分析，為高產酶微生物的分離和篩選提供表征性指導作用，同時也為制曲工藝的改良和加強型特種大曲的研制提供基礎數據。而目前關于不同發酵和貯存期清香型大曲的微生物群落結構還有未有報道。

本實驗采用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術研究不同發酵期和貯存期中溫大曲微生物多樣性及其種群結構。不但解決了傳統培養方法的缺點和局限性，而且從未培養觀點出發全面系統地認識了中溫大曲微生物群落結構，克服了現有大曲未培養研究中在方法選擇、引物設計等方面的缺陷。同時也為基于培養方法的白酒功能微生物的深入開發及應用提供了有效的參考。運用PCR-DGGE方法研究不同發酵期和貯存期中溫大曲的微生物群落結構，將其和大曲風味組成分析、傳統的菌種分離鑒定等方法相結合，對鑒定和判斷大曲制曲過程中與大曲風味物質形成相關的主要微生物、指導大曲生產，具有非常重要的意義[10-14]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

中溫大曲樣品：取川南某酒廠制曲車間發酵期第0、2、4、6、8、10、12 天和貯存期第5、10、15、20天的中溫大曲，粉碎后使20目過篩率在90%以上，即為大曲樣品。

1.1.2 試劑

乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）（分析純）、Triton X-100、引物P2和P3、NS1和GC-fung：生工生物工程（上海）股份有限公司；Goldview染料、十二烷基硫酸鈉（分析純）：上海賽百盛股份有限公司；氯化鈉（分析純）、去離子甲酰胺（分析純）、瓊脂糖、甲叉雙丙烯酰胺（分析純）、尿素（分析純）、冰乙酸（分析純）、Tris堿（分析純）：上海星火化工廠；SYBR Green熒光染料：美國Invitrogen公司；Plasmid Mini kit I：美國OMEGA BIo-Tek公司；PCR試劑：大連Takara公司。

1.2 儀器與設備

MyCycler型PCR儀、Dcode DGGE電泳儀：美國BIO-RAD公司；Bio-Best200E型凝膠成像分析系統：美國SIM公司；TY-80R型脫色搖床、JY-SP-C型水平電泳槽、DZF-6050B真空干燥箱、DK-S28電熱恒溫水浴鍋、TGL-16G臺式高速離心機：上海實驗儀器廠有限公司；thermo 900超低溫冰箱：Thermo Scientific；SW-CG-1F型超凈工作臺：蘇州蘇潔凈化設備有限公司；Nano-200核酸濃度測定儀：通用（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲微生物總脫氧核糖核酸的提取和純化

（1）稱取5 g大曲樣品，加3 g石英砂充分研磨后裝入離心管中，加12 mL 2%十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）抽提液和200μL巰基乙醇，充分振蕩后65℃水浴約1 h。然后加入100μL蛋白酶k，振蕩5 min后放入搖床（37℃、210 r/min）繼續振蕩30 min。

（2）將離心管放入離心機中6 000 r/min、4℃條件下離心10 min，取上清液加等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1，V/V）混合液充分振蕩，然后再12 000 r/min、4℃條件下離心10 min，再取上清液加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1，V/V）混合液，充分振蕩后在相同條件下離心5 min，取上清液，重復兩次，加入0.6倍體積的異丙醇在-20℃沉淀1 h后12 000 r/min離心10 min，倒掉液體。得到的沉淀物用體積分數70%的乙醇洗滌數次，將提取得到的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）吹干后加50μL Elution Buffer溶解，-80℃保存。

1.3.2 PCR擴增

（1）細菌16S rDNA基因V3區PCR擴增

引物為P2和P3。擴增條件為94℃預變性4 min；94℃變性1 min，應用降落PCR，65℃開始退火，每兩輪降低1℃，最終降至56℃，退火1 min；72℃延伸1 min；再94℃變性1 min；55℃退火1 min；72℃延伸1 min，共10個循環，72℃終延伸6 min。

（2）真菌18S rDNA基因PCR擴增

引物為NS1[15]和GC-fung[16]。擴增條件是95℃預變性4 min；93℃變性1 min，應用降落PCR，55℃開始退火，每兩輪降低1℃，最終降至45℃；退火1 min；72℃延伸1 min；再94℃變性1 min；55℃退火1 min；72℃延伸1 min，共10個循環，72℃終延伸6 min，細菌、真菌PCR擴增體系見表1，本研究所用引物見表2。

表1 PCR擴增體系Table 1 System of PCR amplification

表2 本研究中用到的PCR引物Table 2 PCR primers used in this study

1.3.3 DGGE分析

（1）灌制變性梯度凝膠

配制40%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺變性膠（37.5∶1）、50倍TAE緩沖液，配制好的試劑4℃保存。配制10%過硫酸銨分子溶液，于冰箱中4℃保存，溶液盡可能現配現用。冼凈兩塊玻璃板，用電吹風吹干，將塑料夾條夾放十兩塊玻璃板兩側對齊，并用長尾夾夾牢于灌膠架上加入無菌水驗證，確保不漏水之后待用。制作聚丙稀酰胺凝膠的規格為20 cm×20 cm，厚1 mm，凝膠濃度為8%，變性范圍為30%～50%（100%的變性劑中含有去離子甲酰胺（40%）和尿素（7 mol/L））制備梯度膠，根據表3配制兩種變性濃度的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺溶液，配制好后將凝膠吸入兩個注射器中。

表3 變性梯度為30%～50%凝膠的配制[17]Table 3 Preparation of gel with denaturation gradient 30%-50%

（2）電泳分析[18]

在電泳槽里加入1×TAE緩沖液，打開加熱裝置預熱，使緩沖液的溫度達到60℃。取30μL PCR產物加5μL10×loadding buffer，混勻4℃保存。聚丙烯酰胺凝膠凝固好以后拔掉梳子，將長尾夾固定在電泳槽內，將緩沖液的高度調節至剛剛超過加樣孔，用蛋白膠加樣針在加樣孔中加入35μL混勻后的PCR產物。蓋上電泳儀蓋，200 V電壓電泳3.5 h，電泳完后，用SYBR GreenⅠ染色45 min（在避光條件下每隔15 min染色1次），最后用凝膠成像系統拍照，并取出拍照保存DGGE圖譜。

1.3.4 DGGE條帶的克隆測序[19]

將DGGE圖譜中優勢條帶標記后，切膠回收并純化后連接到T載體并轉入感受態細胞，藍白斑篩選后，驗證陽性克隆，最后送交測序公司測序。根據測序結果，利用BLAST在GenBank（NCBI）核酸序列數據庫進行同源序列搜索，以比較代表菌株與已知相應序列的相似程度。

2 結果與分析

2.1 中溫大曲細菌群落結構分析

2.1.1 細菌16S rRNA的DGGE分析

中溫大曲細菌的16S rRNA[20]基因DGGE電泳圖見圖1，細菌DGGE圖譜的分析結果見表4，細菌16S rRNA基因的DGGE切膠條帶的測序結果分析見表5，細菌DGGE圖譜的豐度及條帶優勢度見圖2。

從圖1和表4可以看出，共檢測到22條不同的條帶，這表明在清香型白酒大曲在制曲過程中存在有大量不同微生物菌株，說明大曲細菌種群結構較為復雜，且不同時期的大曲細菌組成存在明顯差異。

圖1 中溫大曲細菌的DGGE指紋圖譜Fig.1 DGGE fingerprint of bacteria in medium temperature Daqu

表4 中溫大曲細菌DGGE指紋圖譜的分析結果Table 4 Analysis results of DGGE fingerprint of bacteria in medium temperature Daqu%

從圖1和表4可知，發酵到第4天時，條帶8、9、10、11、12的亮度增加，說明這幾條條帶代表的細菌是大曲的優勢菌群且數量增多，曲坯開始“穿衣”，品溫達到40℃以上，細菌的生長繁殖開始活躍起來，淀粉類物質逐漸消耗，釋放大量的熱量，使曲塊和曲房的溫濕度迅速上升，同時抑制了不耐熱微生物的生長。隨著發酵的進行，第10天時細菌種類達到最大值，說明曲坯的細菌生長繁殖旺盛，微生物生長逐漸伸至曲塊內部；分析原因是“大火”期間的高溫環境使得微生物的生長受到了抑制，以芽孢桿菌為代表的耐熱細菌數量增加，此過程微生物繁殖代謝仍十分旺盛。到貯存期，細菌種類數目開始明顯減少，由于淀粉的消耗使細菌的生長處于末期，但1、13、14、16、17、18、19和21號條帶亮度明顯，成為中溫大曲的主要細菌結構，不同貯存期大曲的細菌結構基本相同，數量上有所差異，這些細菌也是清香型大曲酒獨特風味的重要來源。

2.1.2 中溫大曲細菌群落DGGE圖譜上條帶的序列分析

根據中溫大曲樣品的細菌PCR-DGEE指紋圖譜，將優勢DGGE條帶切膠回收、克隆測序后，經Blast比對，結果見表5。

表5 中溫大曲細菌群落DGGE圖譜條帶的序列分析Table 5 Sequence analysis of DGGE fingerprint band of bacteria in medium temperature Daqu

由表5可知，回收條帶DNA序列比對的同源性均在98%以上，結合DGGE圖譜可知，在制曲和制酒過程中細菌存在明顯的動態變化。在所測22個條帶中，其中未培養的細菌占較大的比重，說明大曲中還含有部分未知的細菌，其余細菌從屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），假單胞菌屬（Pseudomonas）、魏斯氏菌屬（Weissella）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）。芽孢桿菌包括解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和索氏芽孢桿菌（Bacillus sonorensis），魏斯氏菌包括類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）和高麗魏斯氏菌（Weissella koreensis），假單胞菌主要是以棲稻假單胞菌（Pseudomonas oryzihabitabs）為主，乳酸桿菌包括諾氏乳桿菌（Lactobacillus nodensis）、消化性乳酸桿菌（Lactobacillus alimentarius）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）、乳酸乳球菌亞種（Lactococcus lactis subsp）以及香腸乳桿菌（Lactobacillus farciminis）。其中以乳酸桿菌種類最多，芽孢桿菌次之。

圖2 不同發酵期和貯存期的中溫大曲細菌屬水平的豐度Fig.2 Abundance of bacterial in medium temperature Daqu in genus level in different fermentation and storage periods

由圖2可知，不同發酵期和貯存期中溫大曲細菌的組成基本相同，呈現動態變化的趨勢，未培養的細菌都占了較大部分；發酵前期大曲中Lactobacillus含量最多，其次是Bacillus，Weissella含量隨發酵時間的延長逐漸增大；發酵中后期大曲中Bacillus所占的比例最大，其次是Lactobacillus，和培養條件的變化密切相關；貯存第5天時Weissella和Lactobacillus含量較低，后期逐漸增大，貯存后期大曲已培養的細菌中Lactobacillus、Bacillus和Weissell所占比例基本相同；貯存20 d后大曲中已培養的細菌中Bacillus和Lactobacillus含量最大，占據絕對優勢。

2.2 中溫大曲真菌群落結構分析

2.2.1 真菌18S rRNA的DGGE分析

對大曲中真菌的18S rRNA基因DGGE電泳圖見圖3，真菌DGGE圖譜的分析結果見表6。

圖3 中溫大曲真菌的DGGE指紋圖譜Fig.3 DGGE fingerprint of fungiin medium temperature Daqu

表6 中溫大曲真菌DGGE圖譜的分析結果Table 6 Analysis results of DGGE fingerprint of fungiin medium temperature Daqu%

由圖3和表6可知，從不同發酵期和貯存期的中溫大曲樣品經過DGGE電泳可以分離出18條電泳條帶，其中有6條是共有條帶，大曲樣品發酵開始時真菌數量較少，只有8號條帶亮度較大，隨著發酵的進行到第10天，真菌的數量逐漸增大，種類增多，說明曲坯開始“上霉”，溫度逐漸升高。發酵后期由于溫度過高抑制了部分不耐熱真菌的生長，數量下降，適當控制這一時期的發酵時間，可為大曲積累更多的代謝產物。貯存期大曲的真菌種類和數量變化趨勢基本一致，貯存第10天，部分真菌含量顯著增加，但后期有下降。整體的變化趨勢是剛開始發酵時真菌種類最多，貯存后期真菌數目逐漸減少。

2.2.2 中溫大曲真菌群落DGGE圖譜上條帶的序列分析

根據不同發酵期和貯存期中溫大曲樣品的真菌PCRDGGE指紋圖譜，將優勢DGGE條帶切膠回收、克隆測序后，經Blast比對，結果見表7，真菌DGGE圖譜的豐度及條帶優勢度見圖4。

表7 中溫大曲真菌群落DGGE圖譜上條帶的序列分析Table 7 Sequence analysis of DGGE fingerprint band of fungiin medium temperature Daqu

從表7可以看出在共檢測到18條不同條帶，回收條帶DNA序列比對的同源性均在99%以上，真菌從屬于根霉菌屬（Rhizopus）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、海洋酵母屬（Kodamaea）、維克霉菌屬（Wickerhamomyce）、黃絲曲霉屬（Talaromyces）、酵母菌屬（Saccharomycopsi）、淀粉霉菌屬（Amylomyce）和畢赤酵母屬（Pichia）。其中以霉菌的種類最多，酵母菌次之。

其中淀粉霉（Amylomyces rouxii）、米根霉（Rhizopus oryzae）是重要的液化、糖化菌株；扣囊復膜酵母菌（Saccharomycopsis fibuligera）廣泛分布于自然界中，能夠分泌α-淀粉酶、蛋白酶在內的多種水解酶，異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）也具有提高乙酸乙酯產量、分泌β-葡萄糖苷酶的能力，從而使得酒體風味更加協調、豐滿。

圖4 不同發酵期和貯存期的中溫大曲真菌屬水平的豐度Fig.4 Abundance of fungal in medium temperature Daqu in genus level in different fermentation and storage periods

由圖4可知，不同發酵期和貯存期的中溫大曲真菌中的根霉菌屬和酵母菌屬占據絕對優勢。發酵前大曲中Accharomycopsi、Rhizopus和Pichia是優勢菌，有少部分的Amylomyce、Kodamaea和Lichtheimia，主要來自原料和環境中；當發酵進行時，隨著培養條件的變化，Wickerhamomyce和Amylomyces大量繁殖，含量明顯增大，到發酵第8天時，大曲真菌種類顯著減少，只有Pichia、Rhizopus、Wickerhamomyce和Amylomyce后期逐漸增加。大曲貯存期間，酵母菌和霉菌數量比基本維持不變，各類真菌呈現動態變化的趨勢，酵母菌的數量略高于霉菌。

3 結論

利用PCR-DGGE技術對不同發酵期和貯存期的中溫大曲的微生物群落結構進行分析，全面了解了中溫大曲中的微生物種類和微生物群落結構，可以有效避免傳統培養方法固有局限，得到了大曲中細菌和真菌在不同時期的變化趨勢，從而達到優化中溫大曲的發酵的貯存條件，豐富微生物的種類的目的。

從分析結果來看，DGGE條帶解析出的中溫大曲細菌有19種，細菌從屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），假單胞菌屬（Pseudomonas）、魏斯氏菌屬（Weissella）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus），其中芽孢桿菌屬（Bacillus）和乳酸菌（Lactobacillus）屬于優勢菌群；中溫大曲真菌有13種，從屬于根霉菌屬（Rhizopus）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、海洋酵母屬（Kodamaea）、維克霉菌屬（Wickerhamomyce）、黃絲曲霉屬（Talaromyces）、酵母菌屬（Saccharomycopsi）、淀粉霉菌屬（Amylomyce）和畢赤酵母屬（Pichia），其中根霉屬（Rhizopus）、畢赤酵母屬（Pichia）和酵母屬（Saccharomyces）屬于優勢菌群。不同的時期大曲微生物種類和數量呈動態變化的趨勢，受培養條件（特別是溫度）的影響較大，整體的趨勢是發酵開始時微生物數量較少，到了發酵中期（4～8 d），微生物數量達到頂點，大量細菌和真菌旺盛繁殖，代謝產物不斷積累，發酵后期由于培養環境的變化以及營養的消耗，微生物群落逐漸減少并趨于穩定；貯存期內，微生物的種類的趨于平穩，數量變化較大。