包裝飲用水中銅綠假單胞菌的耐藥分析及同源性研究

劉 艷，王鳴秋，朱必婷，李詩瑤，付文雯，邵翠翠，馬 弋，黃 茜*

（湖北省食品質量安全監督檢驗研究院，湖北 武漢 430075）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）又稱綠膿桿菌，在自然界分布廣泛，土壤、水、空氣及正常人和動物的機體皮膚、呼吸道和腸道中都有該菌的存在，它是一種條件致病菌[1]，能夠產生粘附素、多糖莢膜、內毒素和外毒素等多種致病因子，威脅人體健康[2]，是醫院內感染的主要病原菌之一[3-4]。近年來，銅綠假單胞菌污染飲用水的報道逐漸增多，廖振宇等[5]在492份成品水中檢出7份樣品銅綠假單胞菌陽性，由銅綠假單胞菌引發的食物中毒事件也陸續有報道[6-12]，證實銅綠假單胞菌是一種重要的食源性和水源性致病菌。2015年以前，我國國家標準中只有礦泉水標準有銅綠假單胞菌的檢測指標[13]。在2015年5月24日開始實施的國標GB 19298—2014《食品安全國家標準包裝飲用水》中，銅綠假單胞菌才被列入新增致病菌指標。從全國抽檢信息中公布的包裝飲用水抽檢不合格信息來看，銅綠假單胞菌是造成包裝飲用水不合格的最主要因素之一。目前，國內外對于包裝飲用水，特別是飲用純凈水和其他飲用水中的銅綠假單胞菌污染及其耐藥性分析的文獻研究很少，對于銅綠假單胞菌污染的來源未進行系統分析[14-17]，而常見的分析方法也多集中在多位點序列分析（multilocus sequence analysis，MLSA）、脈沖場凝膠電泳分析（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）等[18-19]，耗時較長且操作較復雜。本研究在湖北省地區選取15家成品水中曾檢出銅綠假單胞菌的包裝飲用水生產企業，采集116份樣品，分析生產過程各環節銅綠假單胞菌污染情況，對分離得到的陽性菌株通過梅里埃藥敏鑒定卡進行耐藥分析，利用基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF MS）同源性研究，以期為包裝飲用水生產企業和食品安全監管部門防控銅綠假單胞菌污染提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：本實驗所用樣品來自湖北省地區2015-2017年監督抽檢中曾檢出銅綠假單胞菌的生產企業（116份）。

假單胞菌瓊脂基礎培養基、乙酰胺液體培養基、金氏B（King's B）培養基、綠膿菌素測定用培養基、營養瓊脂培養基、氧化酶、納氏試劑等：青島高科技工業園海博生物技術有限公司；VITEK-2GN鑒定卡及革蘭氏陰性細菌藥敏鑒定卡：法國生物梅里埃公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA）：德國布魯克公司。實驗所用到試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定儀：法國生物梅里埃公司；autoflex maX基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）：德國布魯克公司；微生物膜過濾系統和配套濾膜：美國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 銅綠假單胞菌的分離鑒定

樣品采集：選用2瓶帶蓋子無菌廣口塑料瓶，擦拭干凈水龍頭嘴里外后，打開水龍頭流2 min，關上水龍頭并用體積分數95%的乙醇棉球灼燒滅菌，再次打開水龍頭讓水流1～2 min后，再接水樣并裝滿取樣瓶。包裝容器則采取隨機抽取桶體，用250 mL無菌生理鹽水淋洗法將淋洗液作為檢測樣品。共采集15家生產企業116份檢測樣品。

銅綠假單胞菌的分離鑒定：按照GB 8538—2016《食品安全國家標準飲用天然礦泉水檢驗方法》[20]中“57銅綠假單胞菌”對采集的樣品進行檢驗。將250 mL水樣用孔徑0.45μm的濾膜過濾，然后將過濾后的濾膜貼在已制備好的假單胞菌瓊脂基礎培養基平板上，平鋪并避免在濾膜和培養基之間產生氣泡。將平板置于（36±1）℃培養40～48 h，并防止干燥。所有顯藍色或綠色（綠膿色素）的菌落，判定為銅綠假單胞菌。將需驗證的可疑菌落（產熒光和紅褐色不產熒光的菌落）劃線接種營養瓊脂培養基，于（36±1）℃培養20～24 h，進行氧化酶試驗、乙酰胺肉湯、金氏B培養基確證性試驗。分離純化后的菌落用VITEK-2 GN鑒定卡進一步確認。

1.3.2 耐藥性分析

采用法國梅里埃公司的革蘭氏陰性菌藥敏卡片（ASTGN13卡）對分離得到的48株銅綠假單胞菌進行藥敏試驗，試驗的藥物分別為：哌拉西林/他唑巴坦（tazobactam，TZP）、頭孢唑林（cefazolin，CEF）、頭孢替坦（cefotetan，CFO）、頭孢他啶（cef-tazidime，CAZ）、頭孢吡肟（cefepime，FEP）、亞胺培南（imipenem，IMP）、阿米卡星（amikacin，AMK）、慶大霉素（gentamicin，GEN）、妥布霉素（tobramycin，TOB）、環丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、左氧氟沙星（levofloxacin，LVX）和呋喃妥英（furadantin，FUR）共12種抗生素，以銅綠假單胞菌ATCC 27853作為質控菌株。

1.3.3 同源性分析

將PA菌株接種于營養瓊脂平板，放置于36℃培養箱中培養24 h。用無菌接種環挑取適量細菌放入1.5 mL EP管，加入300μL純水混勻，再加入900μL無水乙醇振蕩混勻，靜置15 min后離心（12 000 r/min、2 min），棄上清后重復離心，以徹底棄去上清。再向EP管內加入30μL體積分數70%的甲酸，振蕩混勻后再加入20μL乙腈，再振蕩混勻，靜置1 min后高速離心（12 000 r/min、2 min），吸出上清蛋白提取液備用，做好標記及編號。取1μL處理好的上清液點加在MALDITOF MS的樣品靶上，在室溫條件下自然晾干（5～10 min），其上滴加1μL HCCA基質溶液均勻覆蓋其表面，待自然晾干后上機檢測。每一個樣品的蛋白質譜峰通過不同位置100次的激光點擊而獲得，儀器可檢測的蛋白質分子質量范圍為2 000～20 000 Da，得到的蛋白質譜峰信息經軟件校正，然后與儀器內的微生物數據庫圖譜進行比對，從而得到鑒定結果。通過MALDI-TOFMSbiotyper軟件查看分析鑒定結果，并導入圖譜數據庫進行聚類分析，形成主成分分析（principal component analysis，PCA）聚類分析圖譜。

2 結果與分析

2.1 銅綠假單胞菌檢出情況

表1 包裝飲用水生產各環節銅綠假單胞菌檢出結果Table 1 Detection results of Pseudomonas aeru ginosa in packaged drinking water of each production link CFU/250 mL

由表1可知，116份樣品中，共有43份檢出了銅綠假單胞菌，檢出率為37.1%，分別計算各個工藝環節銅綠的檢出率，則水源水、石英砂過濾后水、活性炭過濾后水、精濾后水、臭氧殺菌后水、成品水和清洗前包裝容器的銅綠檢出率分別為40.0%、46.7%、66.7%、66.7%、18.2%、33.3%、20.0%。由此可知，石英砂過濾、活性炭過濾和精濾環節銅綠的檢出率最高，這與企業清洗、更換石英砂、活性炭和濾膜的頻率呈一定的相關性。

對檢出的陽性菌株進行編號，經過分離純化后得到48個分離株，具體信息見表2。在假單胞菌瓊脂基礎培養基平板上，大部分銅綠為藍綠色，少數黃褐色產熒光，典型菌落形態見圖1。

表2 陽性菌株來源及編號Table 2 Sources and number of the positive strains

圖1 假單胞菌瓊脂基礎培養基上典型菌落形態Fig.1 Typical colony morphology of Pseudomonas on agar base medium

2.2 耐藥性分析結果

48株銅綠假單胞菌對頭孢唑林、頭孢替坦和呋喃妥英的耐藥率較高，分別為93.7%、87.5%和83.3%，對頭孢他啶、頭孢吡肟、亞胺培南、阿米卡星、慶大霉素、環丙沙星的耐藥率分別為4.2%、6.3%、2.1%、4.2%、4.2%和4.2%，對哌拉西林/他巴唑坦、妥布霉素和左氧氟沙星均不耐藥（見表3）。其中有6株銅綠假單胞菌（PA1-3、PA3-1、PA5-3、PA9-3、PA12-2、PA14-4）呈現多重耐藥性，PA1-3的耐藥水平最高，來自于活性炭過濾后水。

表3 48株銅綠假單胞菌的藥敏結果Table 3 Drug sensitivity of 48 Pseudomonas aeruginosa strains

2.3 同源性分析結果

通過將48株PA的蛋白質指紋圖譜進行聚類分析，48株PA分為兩大簇（Ⅰ型31株，Ⅱ型17株），按照50%相似性作為判定水平，48株菌可被分為a～f共6個類群，a類群包括：PA1-1a、PA1-1b、PA1-3、PA1-4、PA1-6、PA2-3、PA2-4、PA3-1、PA3-4、PA4-1、PA6-2、PA6-7、PA7-6、PA8-4、PA10-3、PA10-4b、PA12-2、PA12-3、PA12-4、PA12-5、PA12-6、PA13-2、PA14-4、PA14-6、PA15-3和PA15-4。b類群包括：PA1-2、PA5-3、PA7-4、PA9-4b和PA13-3，c類群包括PA3-2和PA9-4a，d類群包括：PA3-7a、PA10-1和PA10-4a，e類群只有PA3-3和PA11-2，f類群包括：PA3-6、PA3-7b、PA6-3、PA7-5、PA9-1a、PA9-1b、PA9-3、PA10-2、PA11-7和PA12-1。

對銅綠假單胞菌蛋白質質譜數據進行主成分分析，歐氏距離反映了各菌株之間的相似程度，結果見圖2。由圖2可知，48株銅綠假單胞菌被聚成了4類。其中，來自于同一生產企業的菌株大多集中在同一類或兩類，但是第3個生產企業的7株菌則被分到3個不同類別，結合樣品的來源分析，發現菌株的分型與其來源沒有明顯的對應關系。

圖2 銅綠假單胞菌主成分分數的三維散點分布圖Fig.2 Three-dimensional scatter plot of the principal component analysis of 48 Pseudomonas aeru ginosa strains

3 結論

本研究從水源及各環節水樣中分別進行銅綠假單胞菌的分離和鑒定，在石英砂過濾、活性炭過濾和精濾環節均有較高的檢出率，說明企業應在這三個環節加強銅綠假單胞菌的風險防控，在控制生產成本的同時加強石英砂、活性炭的清洗效果監測、增加濾膜的更換頻率。耐藥分析顯示所分離到的銅綠假單胞菌的耐藥水平要遠低于臨床分離株，這與銅綠假單胞菌所處的環境不同相關，與國內同行報道基本一致[14]，但仍發現了6株多重耐藥菌株，多重耐藥銅綠假單胞菌幾乎具有目前已知的所有細菌耐藥機制，是引起獲得性肺炎主要細菌之一，其引起的院內感染治療難度極大。加強銅綠假單胞菌耐藥機制的研究，并加強監測包裝飲用水中銅綠假單胞菌的污染現狀及其耐藥情況，從而保障廣大消費群體的飲水安全。

MALDI-TOF MS主要通過細菌蛋白指紋圖譜相似性進行聚類分析，操作過程簡單，但細菌蛋白表達過程中其豐度會受到培養時間、培養基等因素的影響，從而使得MALDITOF MS同源性分析結果具有不穩定性，因此MALDI-TOF MS進行同源性分析具有一定局限性，目前沒有制定統一的質譜標準化操作流程，實驗結果的重復性和可靠性未得到不同實驗室的驗證，尚難以準確定論MALDI-TOFMS同源性分析能力。后續需進一步進行16S測序分析及PFGE分型來進行確證。