耐高溫餐廚垃圾分解細菌的篩選、鑒定及應用

萬文娟 張赟彬,2 聶志妍 毛彥佳 許 靜 喻 瑩

(1. 上海應用技術大學香料香精技術與工程學院，上海 201418；2. 上海中醫藥大學公共健康學院，上海 201203；3. 上海健康醫學院醫學技術學院，上海 201318；4. 上海捷浩后勤設施技術服務有限公司，上海 201400)

餐廚垃圾是家庭、單位食堂以及餐飲行業等在食品生產、加工和消費過程中產生的有機廢棄物[1-2]，容易腐爛，在自然分解過程中，會產生大量的氨氣、硫化物等有害氣體，散發惡臭[3-4]；如果將餐廚垃圾直接作為飼料，其中的致病菌可引發動物染病，人畜交叉感染病，危害人體健康[5-6]。隨著社會經濟的迅猛發展，中國餐廚垃圾的產量也急劇增長。據報道[7]，餐廚垃圾產生量在2015年達到0.62億～1.04億t，已成為影響城市環境健康發展的一個重要問題。國外開展餐廚垃圾快速處理技術的研究較早[8]，隨著經濟的發展以及國家對環保重視程度的提高，中國也已經開始研究。

目前，餐廚垃圾的處理方式主要包括粉碎直排法、脫水處理法、化學處理法、焚燒處理法、厭氧消化法和微生物處理法等[9]。這些方法中除微生物處理法外大都耗能高，甚至對環境造成二次污染[10]，因此，采用微生物法處理餐廚垃圾成為國內外的研究熱點[11-13]。由于中國飲食文化的不同，餐廚廢棄物成分同國外有明顯差別，尤其是其中的油脂類成分、纖維素成分和含鹽量都偏高；此外，從目前中國餐廚廢棄物實際處理的效果來看，國外進口的微生物降解菌制劑不太適用于國內餐廚垃圾的成分，導致處理餐廚廢棄物的成本偏高，而降解效率偏低。因此，針對中國餐廚垃圾研制可高效降解的微生物菌制劑具有較好研究潛力和實際應用價值。而對于餐廚垃圾中4類主要有機物的降解問題，有學者已經做過一些相關研究。有研究表明枯草芽孢桿菌對氨基酸態氮、三氯乙酸可溶性蛋白都有明顯的降解作用[14]，Serratia marcescens和Aeromonas hydrophila對油脂有分解作用[15]，但這些研究只研究了目標菌株對單一有機物的分解效果，對其他有機物的分解效果尚不明確，此外，目前一些研究[16-17]還存在著降解率低、穩定性差等缺點。在較高溫度的條件下微生物對餐廚垃圾降解效率更高[18-20]，因此研制出含耐高溫降解菌的菌制劑，并與相應的餐廚垃圾處理設備相配套，將可實現餐廚垃圾的快速降解。

本研究擬分離耐高溫且能夠高效降解有機物的細菌菌株，制作成菌制劑，配合餐廚垃圾處理設備應用于餐廚垃圾處理工業，以期實現餐廚垃圾的減量化和無害化。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 試驗樣品

取自某高校處理中的餐廚廢棄物，過篩除去其中的骨頭等大塊雜質，混勻，樣品置于55 ℃恒溫恒濕箱中保存。

1.1.2 試驗試劑

革蘭氏染色劑、甲基紅、無水肌酸：分析純，上海源葉生物科技有限公司；

乙醇、氫氧化鉀、三氯化鐵、碘化鉀、碘：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

石油醚：分析純，上海泰坦科技股份有限公司；

過氧化氫、甘油：分析純，上海凌峰化學試劑有限公司；

DNA提取試劑盒：上海生工生物有限公司；

1.1.3 儀器與設備

恒溫恒濕培養箱：HC92-2型，美國SHELLAB制造股份有限公司；

實驗室pH計：FE20-K型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

數顯恒溫水浴鍋：XMTD-204型，常州翔天實驗儀器廠；

電熱鼓風干燥箱：DHG-9140A型，上海凱朗儀器設備廠；

電子顯微鏡：BA210-T型，麥克奧迪實業集團有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：TOMY SX-500型，日本Tomy Digital Biology公司；

電子天平：ME204E/02型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-1800型，島津儀器(蘇州)有限公司；

超低溫冰箱：WMQIS1M型，青島海爾股份有限公司；

水浴恒溫振蕩搖床，VS-WHD型，無錫沃信儀器制造有限公司。

1.1.4 培養基

LA培養基和LB培養基：上海源葉生物科技有限公司；

葡萄糖蛋白胨水培養基：葡糖糖2 g，蛋白胨2 g，氯化鈉1 g，蒸餾水200 g；

剛果紅纖維素培養基：硝酸鈉1.0 g，硫酸鎂0.5 g，酵母浸出粉0.5 g，氯化鉀0.5 g，磷酸二氫鉀0.9 g，磷酸氫二鈉1.2 g，剛果紅0.2 g，纖維素粉5.0 g，酸水解酪蛋白0.5 g，瓊脂15.0 g；

淀粉培養基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，可溶性淀粉2.0 g，瓊脂20.0 g；

蛋白培養基：酵母膏5.0 g，可溶性淀粉10.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，脫脂奶粉50.0 g，瓊脂20 g；

脂肪培養基：蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，CaCl2·7H2O 0.1 g，瓊脂9.0 g，pH 7.4，121 ℃滅菌20 min，冷卻至 40～50 ℃，加入121 ℃單獨滅菌20 min 的Tween-80 至終濃度為1%。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣方法 按GB/T 9695.19—2008的取樣方法取一定量的餐廚垃圾樣品，裝入無菌袋中密封，帶回實驗室，備用。

1.2.2 菌種分離與篩選

(1) 制備樣品稀釋液：使用電子天平精確稱取樣品10 g，倒入250 mL的錐形瓶中，加入90 mL的滅菌生理鹽水，震蕩15 min，使樣品與生理鹽水充分混勻，靜置1 min，制備成為10-1濃度的菌稀釋液，再使用經高溫滅菌的槍頭的移液槍，吸取1 mL上述液體加入9 mL小試管中，制成10-2菌液，以此類推，制得10-3，10-4，10-5濃度梯度的樣品稀釋液。

(2) 涂布：在LA培養基加100 μL各濃度梯度的樣品稀釋液，涂布均勻，各3個平行。

(3) 培養：將經過涂布后的培養皿倒置放于恒溫恒濕培養箱中，在溫度為55 ℃，相對濕度為50% RH的條件下在恒溫恒濕箱中培養48 h。

(4) 分離純化：選取培養后菌落個數為30～300個的培養皿，挑選形態大小不同、有明顯差異的單個菌落，采用平板劃線法在LA培養基上劃線分離，傳代純化4～5次，得到純菌落于4 ℃冰箱保藏。

(5) 菌種保藏：甘油與滅菌生理鹽水按2∶3的體積比配制甘油溶液。將菌株接種于液體試管培養基中，在水浴搖床(55 ℃，120 r/min)中培養24 h，取菌液與甘油溶液按2∶1的體積混勻，于1.5 mL的保藏管于保藏-80 ℃ 的超低溫冰箱[21]。

1.2.3 耐高溫降解菌的分解效果測定

(1) 淀粉降解活性：配置淀粉固體培養基，取上述分離提純后的菌株，點接于淀粉固體培養基，55 ℃下培養48 h，在菌落周圍滴加少量盧戈氏碘液[22]，反應15 s后，使用游標卡尺測量菌落周圍透明圈的直徑D與菌落直徑D0的比值(D/D0)，即為該菌株的淀粉降解活性。

(2) 蛋白質降解活性：配置蛋白質培養基，取上述分離提純后菌株，點接于蛋白質培養基，55 ℃下培養48 h。使用游標卡尺測量菌落周圍模糊圈的直徑D與菌落產生不透明圈的直徑D0的比值，即為該菌株的蛋白質降解活性。

(3) 纖維素降解活性：配置剛果紅纖維素培養基，取上述分離提純后的4類菌種，點接于剛果紅纖維素培養基，55 ℃下培養48 h。使用游標卡尺測量菌落周圍水解圈的直徑D與菌落直徑D0的比值，即為該菌株的纖維素降解活性。

(4) 油脂降解活性：將分離純化后得到的各菌株點接到脂肪培養基平板上，倒置于恒溫培養箱中在55 ℃下培養，48 h后取出，用游標卡尺測定暈圈直徑D與菌落直徑D0的比值，即為該菌株的脂肪降解活性。

1.2.4 菌種鑒定

(1) 形態學鑒定：經過復篩后，選取對淀粉、蛋白質、油脂和纖維素降解效果最好的菌株，通過對分離菌株同《伯杰氏細菌鑒定手冊》相比對，進行形態學鑒定。

(2) 生理生化鑒定：通過革蘭氏染色試驗、糖發酵試驗、V-P試驗、過氧化氫酶試驗、甲基紅試驗和苯丙氨酸脫氨試驗來對有機物分解效果最好的菌種進行生理生化鑒定。

(3) 分子生物學鑒定：取1 mL過夜培養的菌液，入1.5 mL離心管中，8 000 r/min離心1 min，加入180 μL用Enzymatic lysis buffer 配制的20%的溶菌酶溶液，重懸菌液，再根據DNA提取試劑盒步驟要求完成提取成操作。收集DNA溶液，提取的DNA立即在-20 ℃保存。提取的DNA送生工生物工程(上海)有限公司測序。

測序結果分析：16S rDNA序列在核糖體數據庫(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)上比對。

1.2.5 生長曲線測定 保藏菌株活化后，挑取菌落接種于裝有5 mL的液體培養基的試管中，在溫度為55 ℃，120 r/min的水浴恒溫振蕩搖床中培養培養24 h，3組平行。按5%的接種量再次接種于裝有100 mL液體培養基的250 mL的錐形瓶中發酵培養60 h，每隔2 h取樣，在605 nm下測定發酵液值OD值，繪制該菌株的生長曲線。

1.2.6 餐廚垃圾的降解

(1) 菌制劑的制備：將降解效果最好的菌株接種于裝有5 mL滅過菌的液體培養基的試管中，根據生長曲線確定的時間在溫度55 ℃，120 r/min的水浴恒溫振蕩搖床中培養。使用同樣的方法按15%的接種量比再次接種擴大培養，測量菌液濃度。將培養好的菌懸液在6 000 r/min離心10 min，棄2/3的上清液，剩余部分搖晃均勻，備用。

以鋸末粉和活性炭質量比為10∶1作為載體材料，將制備好的濃縮菌懸液按質量比1∶1均勻噴灑在載體材料上制成菌制劑。

(2) 餐廚垃圾降解效果的測定：參考丁杰萍等[23]對于餐廚垃圾中淀粉、蛋白質、脂肪和纖維素主要成分的研究結果，結合日常食物營養成分表配制本試驗的餐廚垃圾模型(表1)。

表1 餐廚垃圾主要構成

將米飯、熟雞蛋、熟青菜、植物油按表1配比，測量水分含量和總重量，制成餐廚垃圾基質。與菌制劑按10∶1的質量比添加到餐廚垃圾處理器中，在55 ℃處理48 h左右，根據餐廚垃圾質量的變化情況測量減量化效果。

2 結果與分析

2.1 菌種分離

根據菌落的形態學特點，在LA培養基上篩選分離出耐高溫的細菌20株，分別命名為：X1、X2、……、X20。

2.2 菌種復篩

將上述分離得到的20株細菌分別進行淀粉、蛋白質、脂肪、纖維素的降解效果試驗，結果見表2。

參照其他研究[24]，D/D0>2則表示該株菌對有機物分解效果較好。由表2可知，編號為X1、X3、X5、X6、X8、X10、X13、X18、X19、X20的D/D0>2，證明這些菌株對淀粉的分解效果較好。而對脂肪類有機物的分解效果，編號為X13和X17的細菌的D/D0>2。對于纖維素的分解效果，D/D0>2的菌株編號有：X6、X7、X8、X9、X11、X13、X14、X16、X17、X18。每株細菌對淀粉、蛋白質、脂肪、纖維素四類主要有機物的分解能力各不相同，綜合各菌株對淀粉、蛋白質、脂肪和纖維素的降解效果，標號為X13細菌菌株對四類主要有機物分解效果俱佳，且分解效果系數>2。因此本研究選用對餐廚垃圾中四類主要的有機物降解效果俱佳的X13做進一步的菌種鑒定。

表2 全部菌株對淀粉、蛋白質、脂肪、纖維素的降解效果

2.3 菌種鑒定

2.3.1 形態學鑒定 菌株X13在LA培養基上的形態圖特征為：菌落為白色，表面粗糙皺褶，邊緣不整齊且較為扁平，無明顯異味，見圖1(a)。

2.3.2 生理生化鑒定 革蘭氏染色：X13菌株經染色，脫色，在顯微鏡下該菌體都呈紫色，為革蘭氏染色陽性見圖1(b)。

圖1 X13菌落形態和革蘭氏染色圖

根據細菌的形態學鑒定方法[25]，觀察菌落的大小、表面特征、是否隆起、顏色、氣味等形態學的特征，再根據革蘭氏染色、過氧化氫酶和V.P試驗等生理生化試驗(表3)進一步判斷，初步確定X13菌株為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。

表3 生理生化試驗結果?

? “+”表示試驗結果為陽性，“-”表示試驗結果為陰性。

2.3.3 基于分子生物學16S rDNA的鑒定 選用X13菌株rDNA長度為1 501 bp的片段進行16S rDNA的測序，測序結果在GenBank數據庫中進行同源性比對，結果(表4)表明，細菌X13 菌株與GenBank中編號為KX785171.1的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)同源性最高，其相似度為100%，菌株X13的16S rDNA的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖2。

2.3.4 菌株生長曲線 根據圖3生長曲線，菌株X13地衣芽孢桿菌的延滯期為極短，在第1個2 h區間內幾乎可以忽略；在此后地衣芽孢桿菌進入對數生長期，其活菌數呈對數增長；在20 h后到達穩定生長期，在此期間活菌數最最高且不再增加；50 h后進入衰亡期，此后活菌數量開始下降。由此可知該地衣芽孢桿菌液體20 h活菌數達到最大，即確定為液體培養適宜時長。

2.3.5 餐廚垃圾降解 本試驗中測得菌懸液離心前的濃度約為8×109CFU/mL，制備的餐廚垃圾水分含量約為22.21%。采用對有機物降解效果最優的菌株地衣芽孢桿菌制作的菌制劑處理自制的餐廚垃圾，55 ℃條件下在小型餐廚垃圾處理機中攪拌發酵48 h后，測得處理后的餐廚垃圾水分含量約為29.18%，餐廚垃圾減量化達到72.82%。

表4 X13菌株16S rDNA比對結果

PCR長度為1 498 bp

圖3 地衣芽孢桿菌生長曲線

3 結論

本研究從餐廚垃圾中篩選出耐高溫的細菌地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，將其與載體配合制作成菌制劑，配合餐廚垃圾處理器使用48 h后，餐廚垃圾的降解率達到72.82%。與已有的研究[26-27]差異在于本研究獲得的有效菌耐高溫且對餐廚垃圾的降解效率高。因此，使用本研究篩選出的耐高溫菌株地衣芽孢桿菌制作的菌制劑能夠快速分解餐廚垃圾，有效縮短餐廚垃圾降解的時間，實現餐廚垃圾的有效減量化。此外，本研究中獲得的地衣芽孢桿菌在較高的溫度下能快速產生分解淀粉、蛋白質、油脂和纖維素的酶類，且在較高的溫度下能加速生化反應的快速進行，與Aurepatipan等[28]和荊哲華等[29]的研究結果部分相似。

盡管降解餐廚垃圾中淀粉、蛋白質、脂肪和油脂四類主要有機物的微生物一般來說以細菌效果最好，但真菌和放線菌等也有一定的降解效率，后續研究將進一步篩選出耐高溫且能高效降解餐廚垃圾的真菌和放線菌，與現有的菌株制成復合菌制劑，再配合餐廚垃圾處理器的各參數研究調試，實現餐廚垃圾的高效降解。