丹參三倍體育性的細胞學分析

張鈮璇 張璐瑤 曹艷楠 鄭桂恒 龍鴻

摘 ?要 ?由丹參四倍體和二倍體雜交獲得丹參三倍體，三倍體植株高度不育。為探討其育性的細胞學機制，我們采用細胞學和解剖學的方法，對其花粉母細胞發育過程中的染色體和細胞學表現進行了觀測。結果表明，丹參三倍體植株生長正常，在花粉母細胞減數分裂過程中存在落后染色體、染色體不均等分向兩極、染色體橋等異常現象，分裂結果產生三分體、微核等，而且花粉粒形態異常，產生畸變，萌發率極低。這些說明，丹參三倍體在生長發育過程中，由于減數分裂過程中染色體數目不平衡，在減數分裂過程中產生各種畸變、異常的染色體和細胞的行為表現，是造成其不育的主要原因。本研究為丹參三倍體育性研究提供理論依據，也為丹參育種生產實踐提供指導。

關鍵詞 ?三倍體;育性;花粉母細胞;減數分裂;丹參

中圖分類號 ?Q945.53 ?????文獻標識碼 ?A

Abstract ?Triploid Salvia， with characters of sterility， was obtained through hybridization of diploid and tetraploid. In order to investigate the cytological mechanisms of its sterility， we observed the chromosome change and cell structure during the development of pollen mother cells. Results showed the triploid plants grew well. Numerous meiotic abnormalities， including lagging chromosomes， asymmetrical separation and chromosome bridges were found during the meiosis process. Micronuclei and triads were observed except tetrads. Moreover， the shape of the pollen was abnormal， and the pollen germination rate was very low. This indicated that the chromosomal and cytological abnormalities in the meiotic process due to chromosome number imbalance may lead to sterility in triploid Salvia. The data could provide experimental supports of fertility of triploid Salvia， and be useful in the breeding of the traditional Chinese medical herb.

Keywords ?triploid; fertility; pollen mother cell; meiosis; Salvia miltiorrhiza

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.08.013

唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）是中國傳統中藥的重要組成，丹參味苦，微寒，有活血祛瘀、痛經止痛、清心除煩、涼血消癰的功效，主要用于胸痹心痛、脘腹脅痛，心煩不眠、痛經閉經、瘡瘍腫痛等的治療[1]。丹參是我國傳統醫藥中應用極為廣泛的中藥之一，在活血化瘀藥方面有著公認的獨特療效，臨床上主要用于治療冠心病、心絞痛、缺血性中風等疾病[1]。近年來，以青蒿素研制獲得科學界最高獎項諾貝爾獎為標志，隨著歐美國家對中國傳統中醫藥的認可度的逐步提高，以及大量丹參復方制劑的成分確定，中國藥典丹參質量標準與歐盟、美國藥典比較接近，丹參在國際、國內市場上的需求量越來越大[2]。野生丹參品種資源開發受限，丹參人工栽培后，各品種間的生物學性狀及生產力、抗病性、商品產量特性等分化明顯，生態適應性、植株特征、花粉粒、染色體、同功酶和品質特性均有顯著差別[3]，丹參新品種培育已經得到較快發展[4]。

遠緣雜交和多倍體化是植物遺傳改良的主要方法。人工栽培丹參的新品種培育過程中，運用這些技術手段，創造特異的新品種，是丹參新品種培育的重要途徑。丹參一般依靠營養繁殖，尤其以莖段扦插、分根為主，有些丹參不能進行有性繁殖[4]。這些特點為丹參遠緣雜交帶來一定困難。多倍化是高等植物進化的重要力量，通過染色體加倍，基因重組，帶來新的變異，形成新的物種。研究表明，約有15%的被子植物在其物種形成過程中經歷了多倍化[5]，超過70%的有花植物是多倍體[6]。多倍體植株具有營養器官體積大，營養成分增多，抗逆性強等特點[7]，尤其在以收獲根莖葉營養器官為目的的中草藥種植中具有重要意義。

陳力等[8]采用未成熟的二倍體丹參種子，生長在1/2 MS+100 mg/L秋水仙堿的培養基中處理后，誘導四倍體并鑒定，再將四倍體丹參與二倍體丹參正、反交（4x♀×2x♂或2x♀×4x♂），結實率都很高，收獲種子播種后獲得三倍體。染色體倍性鑒定結果顯示，丹參染色體基數x為8，二倍體（2n=2x=16）、三倍體（2n=3x=24）、四倍體（2n=4x=32）。田間觀察發現，三倍體丹參地上部分（莖、葉）均比二倍體丹參對照增加1～1.5倍，地下部分（蘆頭、根）比二倍體丹參增加2倍以上。進一步分析結果顯示，三倍體丹參在側根數目明顯增加，三倍體丹參主要活性成分測定顯示，樣品中的丹參酮IIA、丹酚酸B、丹參酮I、隱丹參酮等的含量均超過《中國藥典》規定的水平。

三倍體（3x）是倍數最低的多倍體，一般是由四倍體（4x）與二倍體（2x）雜交產生的，具有多倍體和雜交種產生的雙重優勢，在藥用植物中具有巨大的生產潛力。從理論上講，三倍體高度不育[8]，只能依靠無性繁殖繼代。然而，生產實踐中發現大多數三倍體具有部分可育性，其育性機制不清。本研究以丹參三倍體為材料，通過解剖學、細胞遺傳學的方法，分析了育性相關的細胞學特點，為闡明三倍體育性的機制提供實驗依據，在丹參遠緣雜交和多倍體育種生產實踐中具有一定的實用價值。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

丹參三倍體材料由南開大學生命科學學院陳力教授饋贈，植物材料為三倍體組培苗，經煉苗后移栽至天津農學院試驗田，常規大田管理，由于是組培苗移栽，在生長季植株陸續開花。

1.2 ?方法

1.2.1 ?細胞學壓片 ?丹參三倍體花蕾生長早期，根據花蕾生長的長短不同進行取材，經卡諾氏固定液固定24 h后轉入70%乙醇溶液中，4?℃條件下保存備用。采用常規壓片法進行減數分裂染色體壓片，選取未成熟的花藥（長度在1～3 mm之間），用自來水浸泡、清洗20 min以上，然后用2.5%纖維素酶和2.5%果膠酶的混合酶液（2∶1）在28?℃對材料酶解30 min，水洗后用1 mol/L HCl 60?℃水解10 min，自來水沖洗3次，浸泡20 min，卡寶品紅染色10 min。Olympus BX53顯微鏡鏡檢，Spot Idea CCD相機拍照。

1.2.2 ?石蠟切片制作和解剖結構觀察 ?以丹參三倍體不同發育時期的花藥為試材，用常規石蠟制片法將固定好的材料，分別進行石蠟包埋、制片，顯微結構觀察。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，愛氏蘇木精整染，Leica RM2265切片機切片，切片厚度8～10 μm，Leica DM 4000B顯微鏡鏡檢，觀察丹參三倍體不同發育時期的花藥解剖結構，Leica DFC450 C相機拍照。

1.2.3 ?花粉顯微觀察和萌發試驗 ?參考張志良等[9]的方法;取即將開放的花朵，用鑷子夾出花藥使之鋪展在硫酸紙上陰干，待花粉自然散出后收集備用。離體萌發法采用培養基為0.1 g/L硼酸+10%蔗糖+0.5%瓊脂，倒入適量培養基于載玻片中央，待其稍凝固后用玻璃棒蘸取少量花粉均勻地抖落在上面，再放入濕培養皿中，保鮮膜封皿后置于恒溫培養箱中培養，培養溫度為（252）℃，培養8?h后統計數據。所有處理均重復3次，每個重復選擇10個視野計數。Leica DM 4000B顯微鏡鏡檢，Leica DFC450 C相機拍照。

2 ?結果與分析

2.1 ?丹參三倍體植株及花器形態正常

為了解三倍體丹參植株的生長狀況，本研究對栽培丹參三倍體植株進行了生長發育觀測。丹參三倍體植株生長健壯，從側根繁殖開始，營養生長期約3個月，植株莖葉繁茂，長勢旺盛，株高可達80?cm，進入生殖生長后，植株正常開花，輪傘花序具多朵花，密集組成長及15?cm的頂生總狀花序，花冠藍紫色，唇形，2枚雄蕊形態正常，未出現失水、干癟等萎縮現象（圖1），說明三倍體植株經營養生長后，能夠適時開花，雄蕊2枚正常狀，另外2枚退化不顯著;雌蕊2心皮，形態表現正常，但不收縮而分裂為4枚裂片。我們觀察了丹參二倍體的植株和花器官形態，與三倍體比較，無明顯差異。

2.2 ?丹參三倍體花粉母細胞減數分裂異常

三倍體丹參的體細胞數為24條（2n=3x=24），在前期I觀察到三價體、二價體和單價體，構型為2III+6II+6I（圖2A），在三倍體丹參的花粉母細胞減數分裂后期I，同源染色體彼此分開，分別向兩極移動時，觀察到14個花粉母細胞出現落后染色體（圖2B），7個出現同源染色體分向不均等（圖2C），6個出現染色體橋（圖2D），分別占觀察總數124個花粉母細胞的比例為11.2%、5.6%和4.8%。

2.3 ?丹參三倍體花粉母細胞減數分裂結果產生多分體異常

丹參三倍體在減數分裂后期Ⅱ，觀察到78.30%的細胞為四分體（圖3A），少量含有微核的異常四分體（圖3B）、三分體（圖3C）、二分體（圖3D）等特殊類型，說明對于丹參三倍體而言，大多數花粉母細胞能夠進行正常減數分裂，一部分細胞不能形成四分體，減數分裂結果不正常，可能直接導致不育。

2.4 ?丹參三倍體花藥切片顯示花粉粒形態異常

花粉母細胞減數分裂產生四分體，再發育形成單核花粉粒，進而形成2或3細胞成熟花粉粒。石蠟切片結果顯示，丹參三倍體成熟花藥中花粉粒的形態結構產生變異，與正常發育花藥中的花粉粒形態比較，這些花粉粒中的一部分呈橢圓形、邊緣規整，而另外一部分則形狀不規則，邊緣凹陷，產生畸形，呈敗育狀態（圖4）。統計結果顯示，約54.5%的花粉粒為畸形花粉粒，約占花粉?？倲档囊话?。

2.5 ?丹參三倍體花粉萌發率極低

鑒于丹參三倍體花粉粒部分形態畸變，我們進行了花粉萌發試驗。由于無法區分在上述石蠟切片中觀察到的畸形花粉粒和正常形狀花粉粒，我們采集正常形狀的花藥，對其中的花粉粒進行了萌發試驗。試驗結果表明，丹參三倍體的花粉?；静幻劝l，極個別從萌發孔產生萌發跡象，但并不長出花粉管，其長度過小，無測量意義（圖5）。我們的花粉萌發試驗沒有區分出畸形花粉粒，但結果是所有花粉粒均不萌發。

3 ?討論

天然加倍的多倍體植物在自然界中廣泛存在，并且在進化歷程中逐漸完成二倍體化而成為新的物種。由于多倍體優勢的存在，這些新物種具有自身的生長、發育、遺傳等優勢，在自然競爭中擴大了種群繁衍范圍，增強了適應性，并被人類利用而得以延續下來[10]。獲得三倍體的途徑有三種：一是雌雄配子之一不減數，二者結合后產生;二是兩個精子同時進入胚囊與卵細胞結合;三是用四倍體和二倍體雜交獲得[11]。三倍體丹參就是通過四倍體和二倍體雜交途徑獲得的，二倍體花粉母細胞減數分裂正常[8]。