利用小RNA測序技術檢測貴州西番蓮病毒

嚴佳文 袁啟鳳 解璞 王立娟 馬玉華 王正媛

摘 ?要 ?病毒病害是西番蓮重要病害之一，明確病毒種類可為病害防治提供理論依據。本研究應用小RNA測序技術對6份疑似病毒侵染的西番蓮葉片樣本進行病毒種類鑒定，發現混合樣本中含有黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）和夜來香花葉病毒（Telosma mosaic virus， TeMV）。應用RT-PCR分別擴增6份樣本中2種病毒的外殼蛋白（coat protein， CP）基因序列，進一步證實6份樣本中均含有CMV和TeMV。CMV的CP基因開放閱讀框大小為657 bp，與已報道的其他分離物的一致性為82.3%～95.9%;TeMV的CP基因開放閱讀框為816 bp，與其他分離物的一致性分別為87.8%～99.3%和87.8%～98.3%。上述結果表明，貴州西番蓮中的病毒是CMV和TeMV的分離物，分別命名為CMV-GZ（CP基因登錄號為MH623077）、TeMV-GZ1（MH623078）和TeMV-GZ2（MH623079）。

關鍵詞 ?西番蓮;病毒;小RNA測序;鑒定

中圖分類號 ?S436.67 ?????文獻標識碼 ?A

Abstract ?Virus disease is one of the main diseases of Passiflora edulis， and the identification of virus species can provide a theoretical basis for the disease prevention. In this study， six suspected virus-infected leaf samples were mixed and analyzed by small RNA deep sequencing. Cucumber mosaic virus （CMV） and Telosma mosaic virus （TeMV） were detected from the mixed sample. Viruses identified by small RNA sequencing were validated by virus coat protein gene （CP） specific RT-PCR from the above six samples. CMV and TeMV was detected from all six samples， respectively. The open reading frame of CP gene of CMV and TeMV obtained by RT-PCR was 657 bp and 816 bp， correspondingly. The nucleotide sequence identity of CMV-GZ （accession number： MH623077）， TeMV-GZ1 （accession number： MH623078） and TeMV-GZ2 （accession number： MH623079） was 82.3%95.9%， 87.8%99.3% and 87.8%98.3%， respectively， with the reported CMV and TeMV isolates. CMV and TeMV in P. edulis was first reported Guizhou. The combined infection of the two viruses may be a potential threat to P. edulis.

Keywords ?Passiflora edulis; virus; small RNA sequencing; identification

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.08.018

西番蓮（Passiflora spp.）是西番蓮科（Passifl oraceae）西番蓮屬（Passiflora）果樹，原產于南美洲，約有530個種和400多個人工雜種，其中可食用的有80余種[1-2]。西番蓮兼具食用和藥用價值，具有重要的經濟意義[3]。我國早在1901年就引種西番蓮，目前在臺灣、廣東、海南、福建、貴州、廣西、云南和四川等省區廣泛種植[4]。近年來，西番蓮種植面積迅速擴大，各省區之間引種、苗木銷售活動頻繁，一定程度上加速了各種病害的傳播和蔓延[5]。病毒病害嚴重影響西番蓮的產量和品質，是產業健康發展的主要限制因素之一[6]。

國內外已報道了26種侵染西番蓮的病毒，包括馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）、菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）、香石竹潛隱病毒屬（Carl avirus）、黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）、蕪菁黃花葉病毒屬（Tymovirus）、柑橘粗糙病毒屬（Cilevirus）、煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）、線蟲傳多面體病毒屬（Nepovirus）等[5]。我國主要有黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）、東亞西番蓮病毒（East Asian Passiflora virus， EAPV）、西番蓮斑駁病毒（Passion fruit mottle virus， PaMV）、廣東番木瓜曲葉病毒（Papaya leaf curl Guangdong virus， PaLCuGdV）、大戟曲葉病毒（Euphorbia leaf curl virus， EuLCV）和夜來香花葉病毒（Telosma mosaic virus， TeMV）[6-9]。國內西番蓮病毒病害主要發生在臺灣、福建、海南和廣東等省區[5]，貴州暫未見西番蓮病毒病相關報道。筆者通過田間調查發現貴州各個主產區均有疑似病毒病侵染的植株，部分果園尤為明顯。鑒定侵染貴州西番蓮病毒種類，對于病害防控具有重要意義。

目前已經報道的西番蓮病毒鑒定方法主要有生物學檢測、電子顯微鏡檢測、血清學檢測和分子生物學檢測等[5]。這些方法在植物病毒鑒定方面均得以成功應用，卻也存在一定的局限性。與逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction， RT-PCR）等傳統分子生物學檢測方法相比，小RNA測序技術（small RNA sequencing， sRNA-seq）不僅可以同時鑒定多種DNA或RNA病毒，還能發掘新病毒或新分離物，已被廣泛應于各種植物病毒鑒定[10-15]。本研究應用小RNA測序技術分析了貴州省疑似病毒侵染的西番蓮樣本，結合RT-PCR驗證了鑒定結果，克隆了病毒外殼蛋白（coat protein， CP）基因開放閱讀框序列，并對所鑒定病毒的不同分離物進行了系統發育分析，為貴州西番蓮病毒病的防控奠定了基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

2017年10月—2018年7月在貴州貞豐、鎮寧、望謨、羅甸、平塘和從江采集疑似病毒侵染的西番蓮葉片6份，其中采自平塘的西番蓮品種為‘平塘1號，其他樣本均為‘紫香1號，樣品信息見表1。以健康西番蓮植株作為陰性對照。

1.2 ?方法

1.2.1 ?西番蓮總RNA提取 ?采用TRIzol試劑（Invitrogen，美國）提取6份疑似病毒侵染葉片混合樣品的總RNA，具體方法參照試劑說明書。應用Nanodrop 2000檢測總RNA的濃度和純度，Agilent 2100測定RIN值。選取RIN值≥8.0、OD260/280≥1.8、濃度≥50 ng/μL的RNA用于測序文庫構建。

1.2.2 ?西番蓮sRNA 測序 ?應用Small RNA Sample Pre Kit （Illumina，美國）構建文庫，使用Qubit 2.0進行初步定量，稀釋文庫至1 ng/μL，然后使用Agilent 2100對文庫的插入片段進行檢測。庫檢合格后，用HiSeq2000進行高通量測序，測序單端讀長為50 nt。sRNA測序委托北京百邁克生物科技有限公司完成。

1.2.3 ?sRNA的拼接和注釋 ?去除原始數據中的低質量序列，保留長度為18～35 nt的序列。應用Velvet 1.2軟件對高質量的sRNAs進行拼接，獲得一系列contigs。將上述contigs在NCBI數據庫中進行BLASTn和BLASTx比對，得到可能存在的病毒序列并進行分類和注釋，確定樣本中可能存在的病毒種類。

1.2.4 ?病毒RT-PCR驗證 ?根據拼接得到的病毒核酸序列設計CMV和TeMV的特異引物（表2），用于RT-PCR檢測。分別以6份疑似病毒侵染的西番蓮葉片總RNA為模板，合成cDNA第一鏈，逆轉錄反應體系為：總RNA 2?μg，5×M-MLV buffer 4?μL，M-MLV反轉錄酶（Promega，美國）40 U，10?μmol/μL隨機六聚體引物2?μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，RNA酶抑制劑20 U，以無RNA酶的去離子水補充體積至25 μL。反應程序為：37?℃孵育1 h，70?℃滅活10 min后備用。以cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系25 μL：10×PCR buffer 2.5 μL、10 mmol/L的dNTPs 2 μL、2.5 μmol/L的上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶1 U，cDNA 2 μL，去離子水補充體積至25 μL。PCR反應程序為：94?℃預變性3 min;94?℃變性30 s，復性30?s（退火溫度見表1），72?℃延伸90 s，35次循環，最后72?℃延伸10 min。PCR產物以1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，純化、克隆并測序。TA克隆及陽性克隆篩選方法參照pGM-T連接克隆試劑盒 （天根生化科技有限公司，北京），隨機選擇5個陽性克隆送上海生工測序。獲得的序列應用DNAMAN 8進行比對分析。

1.2.5 ?病毒CP基因克隆及系統發育分析 ?根據拼接得到的病毒核酸序列設計CMV和TeMV的CP基因開放閱讀框（open reading frame， ORF）擴增引物（表2），用于CP基因克隆。PCR擴增、產物克隆測序方法參照1.2.4。在NCBI數據庫中檢索已經報道的侵染西番蓮的CMV以及侵染西番蓮等植物的TeMV的CP基因序列，應用MEGA 7.0對兩種病毒不同分離物進行系統發育分析。采用ClustalW進行多序列比對，設置自展值為1000，以Neighbor Joining法構建系統進化樹。

2 ?結果與分析

2.1 ?西番蓮sRNA測序結果分析

經檢測，西番蓮總RNA濃度為422?ng/μL，OD260/280為8.4，總量為9.7?μg，完全符合sRNA測序要求。sRNA測序獲得28 964 784個reads，除去接頭和低質序列后得到了25?994?547個clean reads，占reads總數的89.76%。sRNA長度為18～35?nt，其中長度為21 nt的數量最多，高達117 303個，其次是22 nt（92 920個）、20 nt （60?100個）和19 nt（38 724個），25～35 nt的sRNA較少，總和為27 940個（圖1）。

序列在NCBI數據庫中的BLAST比對結果顯示，183個contig可以比對到2種病毒序列，其中69個contig可比對到CMV序列，同源性為90%～ 100%;114個contig可以比對到TeMV序列，同源性為65%～93%。以CMV和TeMV基因組序列為參照，將所有contig組裝成4段核酸序列，其中3段序列與CMV的RNA1、RNA2和RNA3全長的覆蓋率分別為85.6%、86.1%和72.5%;1段序列與TeMV基因組的覆蓋率為63.3%（表3）。sRNA序列分析結果表明，6份混合樣本中可能存在CMV和TeMV。

2.3 ?RT-PCR分析

為驗證sRNA注釋結果的可靠性，根據拼接序列設計了CMV和TeMV的特異性引物，分別對6份樣本進行RT-PCR檢測。結果顯示，所有樣品均擴增到2種病毒的核酸片段，大小分別為506 bp和398 bp，與預期大小一致（圖2）。

將PCR產物測序發現：6個樣本的CMV擴增產物序列完全一致，該序列與侵染香蕉（Musanana）的CMV分離物HS-5（KT302188）的CP基因序列一致性為98%，將侵染貴州西番蓮的CMV命名為CMV-GZ;樣本PT的TeMV擴增產物序列與廣西分離物GX1（KJ789129）的CP基因序列一致性最高為99%，將該侵染貴州西番蓮的TeMV命名為TeMV-GZ1;樣本ZF、ZN、WM、LD和CJ的TeMV擴增產物得到2種核酸序列，其中一種與樣本PT的擴增序列完全一致，另一種與GX1的CP基因序列一致性為94%，將此分離物命名為TeMV-GZ2。以上結果說明RT-PCR檢測結果準確可靠，與sRNA拼接及注釋結果一致。樣本ZF、ZN、WM、LD和CJ中含有TeMV-GZ1和TeMV-GZ2 2種分離物。

將PCR擴增產物克隆測序后，分別在NCBI數據庫進行BLAST分析。其中CMV-GZ（MH623077）的CP基因ORF及其氨基酸序列與侵染胡椒（Piper nigrum）的CMV分離物FT （KU255786）的一致性分別為97.1%和100%，與其他侵染西番蓮的分離物CP基因全序列或部分序列的一致性為82.3%～95.9%，與相應氨基酸序列的一致性為97.3%～98.6%（表4）;TeMV-GZ1（MH623078）與TeMV-GZ2（MH623079）的CP基因ORF及其氨基酸序列一致性分別為96.5%和96.7%，兩者與其他TeMV分離物的CP基因全序列或部分序列的一致性分別為87.8%～ 99.3%和87.8%～98.3%，與相應氨基酸序列的一致性為88.3%～98.2%和88.3%～96.7%（表5）。

為進一步明確CMV-GZ、TeMV-GZ1和TeMV-GZ2與已經報道的CMV和TeMV分離物的進化關系，分別以花生矮縮病毒（Peanut stunt virus， PSV， KM823528）和大豆花葉病毒（Soybean mosaic virus， SMV， FJ548849）為外組，基于CP基因序列構建了系統進化樹。侵染西番蓮的CMV分離物分成2支，其中CMV-GZ（MH623077）與巴西的4個分離物（AF418574， AF418575， AF418576， AF418577）、韓國分離物CMV-KoPF（KR 535 607）、中國福建分離物CMV-xm-pf來自不同國家和地區的14個TeMV分離物分成兩個類群（圖5），來自印度尼西亞的8個分離物和來自越南的1個分離物以較高的后驗概率聚為一支，本研究獲得的TeMV-GZ1（MH623078）、TeMV-GZ2（MH623079）分離物與廣西分離物GX1（KJ789129）、泰國分離物Pangda12（AM 40 9187Pangda15（AM409188）組成第2大類群，其中分離物GZ1與中國廣西分離物GX1以較高的后驗概率（PP=100%）先聚為一個分支，而后與分離物GZ2和泰國分離物Pangda12和Pangda15進一步相聚成簇（圖5）。相同地區或寄主來源的分離物優先相聚成簇，表現出較強的地理和寄主特異性。

3 ?討論

本研究應用小RNA測序技術，從6個疑似病毒侵染樣品的混合cDNA文庫中檢測到CMV和TeMV兩種病毒，進一步應用RT-PCR進行了驗證。CMV是雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）的典型成員。紫果西番蓮（Passiflora edulis）被CMV侵染后，嫩葉上有明顯黃點或黃斑，頂部新抽出嫩葉卷曲;老葉有褪綠及黃化現象。病株矮化，花、果明顯減少。黃果西番蓮（Passiflora edulis f. flavicarpa）受侵染也呈典型花葉，老葉上有黃化斑點，但病株無明顯矮化現象[16]。TeMV是馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus，PVY）成員之一，侵染西番蓮引起花葉、葉片皺褶和畸形[17]。這兩種病毒侵染西番蓮在貴州省均為首次報道。

按照國際病毒分類委員會關于馬鈴薯Y病毒的劃分標準，即CP基因氨基酸序列一致性低于80%;CP基因或整個基因組的核苷酸序列一致性低于76%[18]。本研究測定的TeMV-GZ1和TeMV-GZ2分離物CP基因氨基酸、核苷酸序列與已報道的TeMV分離物一致性最高分別為99.3%、98.3%和98.2%、96.7%，高于80%、76%標準，與馬鈴薯Y病毒的劃分標準相符。因此，TeMV-GZ1和TeMV-GZ2是TeMV的兩個分離物。CMV-GZ的CP基因序列與已報道的其他分離物的一致性為82.3%～95.9%，介于張璇等[19]報道的77.1%～100.0%之間，由此可以確定CMV-GZ是CMV的一個分離物。根據寄主范圍、致病性、血清性分析和CP核酸序列分析等，CMV株系或分離物可分為亞組I、亞組II[20]以及兩者的重組型[21]，其中亞組I進一步分為亞組IA和亞組IB。CMV-GZ的CP基因及其氨基酸序列與侵染胡椒的CMV分離物FT（KU255786）CP基因的核苷酸和氨基酸序列一致性分別為97.1%和100%，CMV-GZ可能與FT同屬于亞組IB[22]。RT-PCR驗證結果表明，6份樣品中均存在兩種病毒，且樣品ZF、ZN、WM、LD和CJ同時含有TeMV-GZ1和TeMV-GZ2分離物。

綜合文獻報道和NCBI數據庫中登錄的病毒序列信息來看，侵染西番蓮的CMV主要分布于澳大利亞、美國、南非、巴西、厄瓜多爾、意大利、中國和韓國[5， 16， 23]，系統進化分析結果顯示，意大利分離物單獨聚為一支，巴西、厄瓜多爾、中國和韓國分離物聚為一支。侵染西番蓮的TeMV僅在泰國和中國有報道，而TeMV的其他自然寄主植物廣藿香（Pogostemon cablin）和夜來香（Telosma cordata）主要分布于越南、印度尼西亞等南亞國家。侵染西番蓮的CMV分布更為廣泛，遍布全球西番蓮主產區;TeMV可能源于南亞地區，通過引種或其他途徑傳播到中國。系統發育分析結果顯示，西番蓮TeMV的貴州分離物TeMV-GZ1、TeMV-GZ2與廣西分離物GX1的遺傳距離最小，其次是泰國分離物Pangda12和Pangda15。相同地區或寄主來源的分離物優先相聚成簇，表現出較強的地理和寄主特異性，這與謝麗雪等[6]的研究結果較為一致，該病毒的適應性進化可能同時受地域和寄主植物驅動。

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