益氣解毒化瘀小復方及其單味藥對大鼠腎小球系膜細胞增殖及凋亡影響的研究

王圣治， 陳思敏， 劉英楠， 鄭艷

腎小球硬化是各種原因導致腎小球損傷及病理性改變的最終結局，系膜細胞過度增殖和細胞外基質的合成增多是腎小球硬化的主要病理特征；在多種腎臟疾病的發展中，進行性的系膜細胞凋亡也是導致腎小球硬化進展的重要原因之一。在抗腎小球硬化研究方面，目前中醫藥在該領域研究具有一定優勢及特點，仍然主要集中于抑制系膜細胞增殖和細胞外基質的積聚，促進系膜細胞凋亡方面[1]。本研究旨在探討益氣解毒化瘀消瘀方(黃芪、丹參、白花蛇舌草)及其單藥組對大鼠系膜增生和凋亡的影響，并且提供理論和方法依據，為進一步研究中醫藥防止腎小球硬化奠定基礎。

1材料與方法

1.1 動物 清潔級Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質量(200±20)g，購買自沈陽藥科大學實驗動物處[許可證號：SYXK(軍)2007-004]。

1.2 主要試劑 DMEM培養基干粉(美國GIBCO產品)；MTT(欣博盛生物科技有限公司)；標準胎牛血清(美國Sigma公司)；AnnexinV-FITC(欣博盛生物科技有限公司)；血管緊張素Ⅱ(美國Sigma公司)；大鼠腎小球系膜細胞(武漢博士德生物工程有限公司，編號：HBZY-1，CX0130)。

1.3 實驗藥物 中藥飲片黃芪、丹參、白花蛇舌草由遼寧中醫藥大學附屬醫院藥劑科提供；西藥替米沙坦(德國勃林格殷格翰國際公司)。

1.4 方法

1.4.1 實驗藥物及含藥血清制備 將各組中藥飲片水煎煮并濃縮成相應濃度，濃度分別為黃芪0.7 g/mL，丹參0.25 g/mL，白花蛇舌草水煎0.3 g/mL，小復方組(黃芪、丹參、白花蛇舌草)1.25 g/mL，西藥替米沙坦加入蒸餾水配成濃度為0.6 g/L；60只Wistar大鼠適應性飼養1周后，按隨機數字表法分為正常對照組、小復方組、黃芪組、丹參組、白花蛇舌草組、替米沙坦組，每組10只；正常對照組每日灌服蒸餾水4 mL，各藥物組分別早晚各一次灌服藥液2 mL，連續3 d，第3天灌胃后1 h腹主動脈采血，采血后離心取得血清，于56 ℃水浴30 min，用無菌濾器進行過濾，之后凍存備用。

1.4.2 大鼠腎小球系膜細胞培養 腎小球系膜細胞常規培養于含有10%胎牛血清的DMEM培養液中，置于5%CO2，37 ℃培養箱中培養，2～3 d換液1次，當系膜細胞長至貼壁80%～90%時，磷酸鹽緩沖液洗2次，25 mg/L胰蛋白酶消化、傳代。

1.4.3 隨機分組系膜細胞 將培養后的腎小球系膜細胞隨機分為：正常對照組加入血管緊張素Ⅱ 1×10-6mol/L+正常大鼠血清DMEM液；小復方組加入血管緊張素Ⅱ 1×10-6mol/L+10%濃度小復方組大鼠血清的DMEM液；黃芪組加入血管緊張素Ⅱ 1×10-6mol/L+10%濃度黃芪組大鼠血清的DMEM液；丹參組加入血管緊張素Ⅱ 1×10-6mol/L+10%濃度丹參組大鼠血清的DMEM液；白花蛇舌草組加入血管緊張素Ⅱ 1×10-6mol/L+10%濃度白花蛇舌草組大鼠血清的DMEM液；替米沙坦組血管緊張素Ⅱ 1×10-6mol/L+10%濃度替米沙坦組大鼠血清的DMEM液；血管緊張素Ⅱ組分別加入血管緊張素Ⅱ 1×10-6mol/L+10%濃度胎牛血清的DMEM液。

1.4.4 系膜細胞增殖檢測 采用MTT比色法，將生長狀態良好的大鼠腎小球系膜細胞轉種于96孔板，每組隨機設6個復孔，待培養24 h細胞貼壁，換成無血清DMEM液，使細胞同步于G0/G1期培養24 h，然后分別加入含10%正常大鼠血清和10%含藥血清，每孔200 μL，繼續培養48 h后，棄去培養液，分別于培養結束前6小時加入MTT 20 μL/孔。培養結束后，移去MTT溶液，然后每孔加入150 μL二甲亞砜，用酶聯免疫檢測儀測吸光度值A(570 nm處)，測定各組對大鼠系膜細胞增殖的抑制作用。

1.4.5 細胞凋亡率檢測 大鼠腎小球系膜細胞以1×105/mL濃度接種于培養瓶中，細胞分組分別加入含10%正常及含藥大鼠血清，用800 μL含1%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液重懸細胞，加入碘化丙啶溶液100 μL和RNA酶A 100 μL，37 ℃孵育30 min，固定的樣品過濾后上流式細胞儀分析細胞凋亡。

2 結果

2.1 各組對大鼠腎小球系膜細胞增殖結果 見表1。

表1 各組對大鼠腎小球系膜細胞增殖的影響

注：與正常對照組比較，aP<0.01；與血管緊張素Ⅱ組比較，bP<0.05；與小復方組比較，cP<0.05。

表1結果表明，與正常對照組比較，血管緊張素Ⅱ組能促進腎小球系膜細胞增殖水平升高，差異有統計學意義(P<0.01)，提示系膜細胞增殖模型建立成功。與血管緊張素Ⅱ組比較，各藥物組對血管緊張素Ⅱ誘導的系膜細胞增殖均有抑制作用，差異有統計學意義(P<0.01)；各藥物組與小復方組比較，小復方組抑制腎小球系膜細胞增殖作用最顯著，差異有統計學意義(P<0.01或0.05)；其余各組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。藥物血清在作用24、48 h之間比較差異無統計學意義(P>0.05)，表明藥物抑制大鼠腎小球系膜細胞增殖作用不隨時間的延長而有顯著性變化。

2.2 碘化丙啶單染流式細胞儀檢測分析大鼠腎小球系膜細胞凋亡率 見表2。

表2 各組對大鼠腎小球系膜細胞凋亡率的影響

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與血管緊張素Ⅱ組比較，bP<0.05；與小復方組比較，cP<0.05。

表2結果表明，與正常對照組比較，血管緊張素Ⅱ組能降低腎小球系膜細胞凋亡率，差異有統計學意義(P<0.01)；與血管緊張素Ⅱ組比較，各藥物組均能夠增加系膜細胞凋亡率，差異有統計學意義(P<0.05)；各藥物組與小復方組比較，小復方組抑制腎小球系膜細胞凋亡作用最顯著，差異有統計學意義(P<0.01或0.05)；其余各組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

系膜細胞是腎小球最活躍的固有細胞，除具有單核巨噬細胞的吞噬功能，還具有分泌細胞外基質、產生細胞因子(即系膜細胞的自分泌作用)等功能，因免疫反應、炎癥反應、高血壓等因素可刺激系膜細胞的增殖，而引起細胞外基質合成增多、成分異常，隨病變進展繼而引起或加重腎小球硬化，最終可導致終末期腎病[2-4]。正常生理條件下，腎小球系膜細胞的自我更新和凋亡是同時存在的，且隨著研究的進展，人們意識到腎小球系膜細胞凋亡有正面作用及其負面作用[5-6]：系膜細胞異常增殖參與了諸多腎小球疾病的發生發展，通常會以白細胞浸潤和系膜細胞增殖為特征，細胞凋亡可清除浸潤的白細胞、過度增殖的系膜細胞及去除腎纖維化治愈后的成纖維細胞，這時的細胞凋亡有益于腎組織的重塑與腎小球結構與功能的恢復；然而在多種腎臟疾病如中毒性腎病、腎小球腎炎、梗阻性腎病的發生發展過程中，系膜細胞的凋亡使得大量細胞被清除，而致腎小球基底膜裸露及足細胞丟失、進行性的系膜細胞丟失導致腎小球硬化，缺乏細胞再生導致腎小管萎縮，這時發生的細胞凋亡則是腎小球硬化和腎功能損傷的加重因素。換言之，腎小球腎炎的特征性病理特征是炎癥性細胞浸潤，細胞外基質積聚和腎小球系膜細胞增殖，均導致腎小球硬化和瘢痕形成；由于腎小球系膜細胞擴張可以預示腎小球瘢痕形成，因此系膜細胞的自我更新可能是重要的。在某些形式的腎小球損傷中，腎小球系膜細胞增殖消退，腎小球結構和功能恢復正常。在系膜增生性腎小球腎炎中，系膜細胞凋亡是系膜細胞過度消退的主要修復機制[7-8]。細胞凋亡也是進行性新月體腎小球腎炎中愈合和瘢痕形成的特征[9]。這些研究表明細胞凋亡在腎小球炎癥和愈合過程中很重要，但其失調可能導致瘢痕形成和進展為腎小球硬化。例如，在諸如IgA和狼瘡性腎炎的腎小球疾病中，細胞耗竭是通過細胞凋亡，其隨后發展為硬化[10]。增殖和凋亡之間的平衡可能是損傷期間和之后腎小球重塑的重要機制。因此，抑制系膜細胞增殖和細胞外基質的積聚，促進系膜細胞凋亡，操縱這些途徑可以限制腎小球瘢痕形成，緩解腎小球硬化，保護腎臟功能方面起著重要的作用。

前期研究結果顯示，小復方對轉化生長因子β1基因表達具有明顯的抑制作用，并抑制腎小球系膜細胞基質中合成和分泌纖維蛋白、Ⅳ膠原，增加細胞外基質降解，以有效的預防腎小球硬化[11]。最近研究結果表明，黃芪注射液對腎間質纖維化有明顯改善，黃芪含藥血清可減少細胞外基質的主要組成部分Ⅳ型膠原的生成，降低表達人類系膜細胞表面CD4 mRNA[12]；黃芪含藥血清可通過下調核因子кB、基質金屬蛋白酶-2、Fas/Fas L mRNA表達水平的作用機制，達到抑制大鼠系膜細胞增生的目的[13]；黃芪總皂苷能抑制高糖誘導下系膜細胞的過度增殖[14]。許多促炎性細胞因子參與了細胞增殖的調節，丹參可以通過干擾促炎性細胞因子產生以抑制系膜細胞增殖[15]；丹參注射液可以降低系膜細胞中纖溶酶原激活物抑制物-1 mRNA基本表達及蛋白分泌，下調轉化生長因子β1分泌，提高活性氧簇水平，從而抑制細胞外基質降解，延緩腎小球硬化[16]。有研究表明，白花蛇舌草抑制血管緊張素刺激的系膜細胞外基質纖維蛋白mRNA、轉化生長因子β1mRNA表達及纖維蛋白的合成，從而發揮抗腎小球纖維化的作用[17]。本實驗旨在通過最佳小復方與其單味中藥的比較，以確定其抗腎小球硬化的作用機制，并明確最優藥物。本實驗將各藥物組干預后的大鼠腎小球系膜細胞進行體外培養，并選用血管緊張素Ⅱ對腎小球系膜細胞進行誘導性增殖后觀察各組腎小球系膜細胞增殖及凋亡情況，從而對小復方(黃芪、丹參、白花蛇舌草)、其組成的單味藥及西藥替米沙坦各組進行了對比實驗研究；結果表明小復方(黃芪、丹參、白花蛇舌草)組抑制大鼠腎小球系膜細胞增殖及促進系膜細胞凋亡作用最強，與各單味藥組及替米沙坦比較有明顯差異性。說明了中藥復方在減緩腎小球系膜細胞增殖及促系膜細胞凋亡方面具有多途徑、多靶點治療的優勢。本研究結果表明，黃芪、丹參、白花蛇舌草以及益氣解毒化瘀小復方均可以抑制由血管緊張素Ⅱ誘導的腎小球系膜細胞增殖，其中小復方的效果最佳，其單味藥組療效無明顯差異；說明益氣解毒化瘀在抑制腎小球系膜細胞增殖具有優勢。