hsa_circ_0016788對結(jié)直腸癌遷移和侵襲的影響

李好 周武碧

環(huán)狀RNA（circRNA）是一類通過特殊的環(huán)形拼接形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的RNA，相較于微小RNA（miRNA）和長鏈非編碼RNA（lncRNA），circRNA在哺乳動物細胞中具有更高的穩(wěn)定性和序列保守性。circRNA可以與miRNA結(jié)合充當“miRNA海綿”，也可以在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達，從而間接調(diào)控蛋白表達[1-4]。已有相關文獻報道circRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切[5-10]。有學者通過微陣列分析，首次發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0016788在肝癌組織中高表達，且能促進肝癌細胞的增殖[11]。目前關于hsa_circ_0016788在結(jié)直腸癌中的作用尚未完全清楚，故本研究探討了結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中hsa_circ_0016788的表達差異，同時分析結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788表達與患者臨床特征的關系及對預后的影響，并采用體外細胞遷移實驗驗證hsa_circ_0016788與結(jié)直腸癌細胞遷移、侵襲能力的關系，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料及細胞系來源 cDNA組織芯片（包含80例結(jié)直腸癌組織標本和15例癌旁正常組織標本）購自上海芯超生物科技有限公司，包含了完整的臨床資料（如年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期等）及隨訪資料，患者手術時間為2006年2月至2010年2月，隨訪至2015年9月，隨訪期間病死44例，所有患者術前未予放化療。4株結(jié)直腸癌細胞（HT-29、HCT116、SW480、LOVO）和 1株正常腸上皮細胞（HCO）購自上海中科院生物化學研究所，所有細胞在10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。

1.2 hsa_circ_0016788表達水平檢測 使用Trizol試劑提取結(jié)直腸癌細胞及正常腸上皮細胞RNA，使用2μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；抽提質(zhì)檢cDNA組織芯片腫瘤組織和癌旁正常組織RNA后（由上海芯超生物科技有限公司完成），鋪于96孔板上。使用RT-PCR試劑和ABI 7500 PCR儀器檢測細胞株和cDNA組織芯片中hsa_circ_0016788表達水平。以甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，測得的hsa_circ_0016788與GAPDH的閾值循環(huán)數(shù)（Ct）之差為 ΔCt，使用 2-ΔΔCt計算 circRNA的相對表達量；以上實驗步驟重復3次，取平均值。引物序列：GAPDH正向5′-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3′，反向 5′-ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT-3′；hsa_circ_0016788 正 向 5′-CAGTTTATGATTGCCGTCCTCC-3′，反向 5′-GTGATCGTCTAGGTGGTAACC-3′。取80例結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788相對表達量的中位數(shù)，＜中位數(shù)則定義為hsa_circ_0016788低表達，≥中位數(shù)則定義為hsa_circ_0016788高表達。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染 3條hsa_circ_0016788的siRNA由上海吉凱基因有限公司合成。將5×105個細胞鋪在6孔板中，經(jīng)過24h，細胞密度達70%～80%。使用lipo2000轉(zhuǎn)染siRNA或陰性對照序列，孵育48h后收集細胞，采用RT-PCR法檢測RNA敲減效率。siRNA寡核苷酸序列：si_circ_0016788-1#5′-CTTCAGGCACAGGTAGGTCT-3′，si_circ_0016788-2#5′-CTACTTCAGGCAGTCTTCC-3′，si_circ_0016788-3#5′-AGGCACAGGTCTTCCCAAGGG-3′。

1.4 細胞遷移及侵襲實驗 取轉(zhuǎn)染后狀態(tài)良好的實驗組和對照組細胞，胰酶消化收集細胞，使用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為5×105/ml，將細胞懸液以200μl/孔加入Transwell上室（侵襲實驗需要事前鋪一層膠在小室中），加入600μl培養(yǎng)液在下層小室；孵育24h，使用棉花球?qū)⑸蠈游赐ㄟ^小孔的細胞擦去，而通過小孔的細胞作甲醛固定、結(jié)晶紫染色，并在顯微鏡下計數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。繪制Kaplan-Meier曲線，hsa_circ_0016788高、低表達者生存率比較采用log-rank法。采用Cox比例風險模型分析影響結(jié)直腸癌患者預后的因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織中hsa_circ_0016788表達的比較 結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788相對表達量為4.26±0.15，明顯高于癌旁正常組織的1.59±0.16（P＜0.05）。

2.2 結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788表達與患者臨床特征的關系 結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788表達與患者N分期、TNM分期有關（均P＜0.05），與患者年齡、性別、T分期等均無關（均P＞0.05），見表1。

表1 結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788表達與患者臨床特征的關系[例（%）]

2.3 hsa_circ_0016788對結(jié)直腸癌細胞遷移及侵襲能力的影響 對4株結(jié)直腸癌細胞（HT-29、HCT116、SW480、LOVO）和1株正常腸上皮細胞（HCO）中hsa_circ_0016788表達進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4株結(jié)直腸癌細胞中hsa_circ_0016788 相對表達量（4.17±0.20、3.47±0.25、3.20±0.20、1.83±0.25）均明顯高于正常腸上皮細胞（1.00±0.23），差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖1a。選取HCT116轉(zhuǎn)染3個siRNA敲減circ_0016788，siRNA 1#效果明顯，hsa_circ_0016788表達明顯下調(diào)（P＜0.05），見圖 1b。選擇siRNA 1#進行功能實驗，敲減hsa_circ_0016788后，HCT116細胞的遷移、侵襲能力均明顯下降（均P＜0.05），見圖 2（插頁）。

圖1 結(jié)直腸癌細胞中hsa_circ_0016788相對表達量比較（a：4株結(jié)直腸癌細胞及1株正常腸上皮細胞中hsa_circ_0016788相對表達量比較；b：HCT116細胞轉(zhuǎn)染si-circ_0016788后hsa_circ_0016788相對表達量比較）

圖2 體外細胞實驗敲減hsa_circ_0016788后對HCT116細胞遷移及侵襲能力的影響（a、c：HCT116細胞轉(zhuǎn)染si-circ_0016788后遷移能力明顯下降；b、d：HCT116細胞轉(zhuǎn)染si-circ_0016788后侵襲能力明顯下降；結(jié)晶紫染色，×100）

2.4 結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788表達與患者預后的關系 經(jīng)生存分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788高表達的患者總體生存率低于低表達者（P＜0.05），見圖3a。對Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌患者分別進行生存分析，均為hsa_circ_0016788高表達患者生存率低于低表達者（均P＜0.05），見圖3b-c。經(jīng)Cox比例風險模型分析，結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788高表達是影響結(jié)直腸癌患者預后的獨立危險因素（RR=22.712，P＜0.05），見表 2。

圖3 結(jié)直腸癌患者hsa_circ_0016788高、低表達者的Kaplan-Meier生存曲線（a：80例結(jié)直腸癌患者；b：39例Ⅱ期結(jié)直腸癌患者；c：36例Ⅲ期結(jié)直腸癌患者）

表2 影響結(jié)直腸癌患者預后因素的Cox比例風險模型分析

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788相對表達量明顯高于癌旁正常組織，這表明hsa_circ_0016788可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生，其高表達可能促使結(jié)直腸癌細胞增殖或突變，從而形成腫瘤。腫瘤細胞一般先侵襲局部基底膜或微血管轉(zhuǎn)移至局部淋巴結(jié)，再通過淋巴循環(huán)或血循環(huán)形成遠處轉(zhuǎn)移，因此腫瘤是否具有侵襲性、有無局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對判斷預后十分重要[12-15]。本研究進一步分析發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0016788表達與N分期（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）有關；體外遷移實驗和侵襲實驗驗證hsa_circ_0016788能促進結(jié)直腸癌細胞的遷移和侵襲，提示hsa_circ_0016788可能具有促使結(jié)直腸癌患者發(fā)生腫瘤局部侵襲及遠處轉(zhuǎn)移的作用。Zhang等[16]報道了由hsa_circ_0016788翻譯而來的三維序列包含蛋白11，通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程來促進肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。然而，EMT過程在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程中廣泛存在，該過程將上皮細胞重新編程，使其具有間充質(zhì)表型，更易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[17]。因此，筆者推測hsa_circ_0016788也可能通過EMT過程來促進結(jié)直腸癌細胞的侵襲和遷移，但是需要后期實驗進一步驗證。既往研究表明，hsa_circ_0016788具有促進肝癌細胞增殖的功能[11]；但本研究未發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0016788與結(jié)直腸癌細胞增殖有關。本研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0016788高表達的結(jié)直腸癌患者總體生存率明顯低于低表達者，結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788高表達是影響患者預后的獨立危險因素。

綜上所述，hsa_circ_0016788可能促進了結(jié)直腸癌的遷移和侵襲，后期仍需動物實驗和體內(nèi)實驗進一步驗證；同時其高表達提示結(jié)直腸癌患者預后不良。