HPLC法測定瀉痢固腸丸中去氫二異丁香酚的含量

劉東升 朱 琳 蘇 蕊 徐繼軍 姚世霞 朱旭江

1.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省中藏藥檢驗檢測技術工程實驗室，甘肅 蘭州 730070

瀉痢固腸丸(水丸)處方由元代《丹溪心法》卷六中的古湯方加減，現行標準收載《衛生部藥品標準中藥成方制劑第四冊》[1]，由人參、白芍、肉豆蔻(煨)等九味藥組成，具有健脾化濕、益氣固腸作用。其中處方中的肉豆蔻為肉豆蔻科植物肉豆蔻(MyristicafragransHoutt.)的干燥種仁。具有溫中行氣、澀腸止瀉之功。其主要成分為揮發油和脂肪油以及一些非揮發性的活性成分去氫二異丁香酚，具有較強的抑菌作用。2015年版《中國藥典》一部在肉豆蔻單藥材項下收錄了HPLC法測定去氫二異丁香酚含量的內容[2-7]。但瀉痢固腸丸的現行質量標準中沒有收載相關的質量標準，為了更好的控制該成藥的質量，選擇肉豆蔻為研究對象，采用反相高效液相色譜法對肉豆蔻中的化學成分去氫二異丁香酚進行含量測定，方法簡便、準確為控制肉豆蔻藥材的質量提供很好的依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫1200高效液相色譜儀；德國Sartorius電子分析天平； KQ-500E數控超聲波清洗器。

1.2 材料 去氫二異丁香酚對照品(批號：Z09681，上海源葉)；瀉痢固腸丸(A廠、B廠)；甲醇(分析純)；水為超純水。樣品為2017年國抽樣品兩個廠家14個批次。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用試驗 色譜柱： Agilent 5 TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(70∶30)；檢測波長：274 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：25 μL；理論塔板數按去氫二異丁香酚峰計算應不低于3000，去氫二異丁香酚與其他成分分離度符合要求。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取對照品1.487 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取3 mL至100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細，稱取約0.5 g，置具塞錐形瓶中，加75%甲醇50 mL，精密稱定，超聲提取30 min(功率500 W，頻率40 Hz)，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補足減失的重量，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 精密稱取陰性樣品粉末約0.5 g, 照供試品溶液的制備項下的方法制備。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性實驗 在2.1項下色譜條件下，分別精密吸取對照品、供試品和陰性對照溶液各25 μL進樣，記錄色譜圖。發現陰性對照在與對照品色譜峰相同的保留時間處無干擾，且基線平穩，表明該方法專屬性良好。如圖1所示。

2.3.2 工作曲線與線性范圍 分別精密吸取對照品溶液2、5、10、15、20、25、30、35 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積積分值，以對照品溶液的濃度(μL/mL)為縱坐標(X)，峰面積積分值為橫坐標(Y)作圖，得到近過原點的一條直線。計算回歸方程：Y=94.79632X+0.72567，r=0.99996。結果表明去氫二異丁香酚對照品在0.3569～6.2454 μL/mL濃度范圍內有良好的線性關系。

2.3.3 精密度實驗 取對照品溶液，精密量取25 μL，注入液相色譜儀，連續測定6次，結果峰面積RSD為0.4%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性實驗 精密吸取同一供試品溶液(批號：15081397)25 μL，分別于0、4、8、12、18、24 h 6個時間點注入液相色譜儀，測定待測成分峰面積RSD為2.5%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.5 重復性實驗 精密稱取同一批號的供試品(批號：15081397)6份，按本標準擬定的方法平行測定，并計算樣品中待測成分的含量RSD為1.4%(n=6)，表明供試品溶液重復性良好。

2.3.6 回收率實驗 取已知去氫二異丁香酚含量的供試品(批號：15081397)6份，按供試品溶液中去氫二異丁香酚含量的100%精密加入去氫二異丁香酚對照品溶液(濃度為0.004461 mg/mL)10 mL，置具塞錐形瓶中，氮氣吹干，精密稱取樣品約0.25 g于同一錐形瓶中按供試品溶液的制備方法同法處理，并測定其待測成分含量。結果回收率為101.6%，且RSD小于3.0(n=6)。結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果

2.4 含量測定 按上述色譜條件對14批供試品進行測定，結果見表2。A和B兩個生產廠家的樣品中去氫二異丁香酚含量在0.07～0.32 mg/g之間，數據較為分散，可能跟不同生產廠家生產工藝和原藥材質量控制有很大關系。結合限度規定發現只有A生產廠家(批號：150714)的一批樣品低于限度規定，可能與生產企業原藥材的質量有關。

表2 樣品測定結果

3 討論

3.1 限度規定 根據2015年版《中國藥典》一部肉豆蔻項下規定按干燥品計算去氫二異丁香酚(C20H22O4)應不得少于0.10%，考慮藥材投入制劑的實際情況，按處方理論量折算，扣除水分，限度確定為：本品含肉豆蔻以去氫二異丁香酚(C20H22O4)計，每1 g不得少于0.022 mg。

3.2 提取溶劑的選擇 比較了用甲醇和不同比例的甲醇水溶液(65%、75%和85%甲醇)提取溶劑來提取本品，結果表明用75%甲醇提取比較充分，且出峰時間和峰形比較理想。因此選用75%作為提取溶劑。

3.3 流動相的選擇 比較了甲醇-水(70∶30)和甲醇-水(60∶40)、甲醇-0.1磷酸(70∶30)、甲醇-乙酸銨(85∶15) 四種流動相，結果表明去氫二異丁香酚在甲醇-水(70∶30)等度洗脫下出峰時間和峰形理想。因此作為最終的流動相。