不同孵化時期雞蛋蛋清小分子多肽的鑒定及功能分析

朱方莉,孫浩浩,何鐘瑜,陳 璨,邱 寧,*

(1.國家蛋品加工技術研發分中心,湖北武漢 430070; 2.華中農業大學食品科技學院,湖北武漢 430070)

雞胚蛋是指受精蛋在適宜條件下進行孵化一段時間后,并未破殼且具有生命力、可食用的雞蛋[1]。受精蛋在孵化過程中只與外界進行氣體及熱量交換,雞蛋本身提供胚胎生長所需的全部營養物質。蛋清和蛋黃中的蛋白質以完整蛋白的形式或降解成肽段進入雞胚，為其生長發育提供營養[2]。目前研究表明,雞胚蛋孵化早期粗蛋白含量逐漸增多,中期趨于平穩,在孵化第14 d時其含量達到最高值,后期蛋白質開始被雞胚所吸收利用,故在此階段呈降低趨勢[3]。然而,目前對于雞胚蛋中蛋白質或肽段何時進入胚胎,且在其中如何發揮的功能還有待研究。

大部分關于雞蛋蛋白質的研究大多是基于其功能活性,如分離提取雞蛋蛋清中抗氧化性活性肽和抗血管緊張素轉化酶肽[4-5],以及對雞蛋黃漿質的肽組學研究等[6],但關于雞胚蛋中蛋清產生的多肽種類以及與雞胚發育之間的聯系還未見報道。研究表明利用蛋白酶水解的卵轉鐵蛋白抗菌活性肽與完整蛋白均具有較好的抑菌活性[7],也有文獻[8-9]報道雞蛋蛋白質水解物中的多肽同樣也能夠影響雞胚心血管、骨骼和免疫系統的發育。實驗室前期研究發現,在孵化以及貯藏過程中,高分子量的蛋白質會發生互相作用,通過質譜鑒定發現其成分是蛋白與肽的結合產物[10];另外在雞胚蛋孵化前期發現蛋清中的蛋白質在內源酶作用下能夠發生不同程度的降解[11],因此有必要對孵化過程中蛋清蛋白質所降解的小分子多肽進行分析。

本文通過SDS-PAGE和MALDI-TOF MS/MS串聯質譜鑒定技術,采用“自上而下”的方法對不同孵化時期蛋清中的小分子多肽進行研究,分析孵化過程中蛋清產生肽段與雞胚發育之間的內在聯系,為開發雞胚蛋蛋清天然活性肽提供了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白來航受精蛋(選用雞齡相同,同一批次生產的24 h內新鮮雞蛋) 華中農業大學動物實驗中心;考馬斯亮藍R-250 北京索萊寶科技有限公司;蛋白質電泳預染Marker Thermo Scientific公司;SDS-PAGE試劑盒 武漢谷歌生物科技有限公司;尿素、硫脲、三羥甲基氨基甲烷、丙烯酰胺、乙腈、乙醇、冰醋酸、四甲基二乙胺 均為國產分析純(AR),國藥集團化學試劑有限公司;STD緩沖液、尿酸(UA,8 M尿素;150 mmol/L Tris-HCL)、吲哚-3-乙酸(IAA)、CHCA基質溶液(50%乙腈,0.1%三氟乙酸) Sigma公司。

ALPHAI 1-4型真空冷凍干燥機 德國CHRIST公司;NanoDrop 200C型分光光度計 Thermo Scientific公司;HY-2調速多用振蕩器 國華電器有限公司;3-30 K冷凍離心機 珠海黑馬醫學儀器有限公司;DYCZ-24D電泳裝置 北京六一儀器廠;UltrafleXtremeTMMALDI-TOF-TOF質譜儀 AB SCIEX公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋清樣品制備 將受精蛋在溫度37.8 ℃,相對濕度60%的條件下進行孵化。分別在孵化的第0、6、8、10、14、16、18 d各取出9枚受精蛋作為實驗材料。受精蛋要先-80 ℃冰箱預凍2 h,再分離蛋黃和蛋清,防止雞胚蛋的其它部分污染樣品,然后使用真空冷凍干燥機凍干(-40 ℃,35 h,0.01 MPa左右)成粉末備用。

1.2.2 SDS-PAGE凝膠電泳 按照Laemmli等[12]描述的方法,對第0、6、8、10、14、16、18 d的蛋清樣品進行凝膠電泳。

1.2.3 小分子多肽樣品的制備 分離并提取雞胚蛋蛋清中的小分子多肽:稱取2 g凍干的蛋清樣品,將其溶解于100 mL去離子水中,在8000 r/min 4 ℃下離心20 min,將所得上清液用0.45 μm微孔濾膜進行微濾,最后再用10 kDa超濾管對所得濾液進行超濾,得到分子量小于10 kDa的小分子多肽樣品。冷凍干燥后將其置于-80 ℃條件下密封保存(凍干條件同1.2.1)。小分子多肽提取過程在4 ℃下進行。

1.2.4 質譜鑒定 用滅菌槍頭吸取凍干后的小分子多肽樣品,加入30 μL STD緩沖液,沸水浴加熱5 min,冷卻至室溫后,加入200 μL UA緩沖液混合均勻,將其置于10 kDa超濾管進行超濾,加入200 μL UA緩沖液后,8000 r/min 4 ℃下離心20 min,取沉淀,向其中加入100 μL IAA,震蕩1 min后,避光放置30 min,8000 r/min 4 ℃下離心5 min。再加入100 μL UA緩沖液,10000×g 4 ℃離心5 min,重復2次。加入40 μL的25 mmol NH4HCO3,放置過夜后8000 r/min 4 ℃離心10 min,再加入40 μL 25 mmol的NH4HCO3,進行8000 r/min 4 ℃離心5 min,然后用0.1%甲酸進行酸化至pH為5。

將得到的樣品進行凍干后,取2 μL 20%的乙腈復溶,取1 μL溶解后的樣品,直接于樣品靶上進行點樣,等待溶劑自然風干,取0.5 μL過飽和的CHCA基質溶液,于對應靶位上點樣并自然風干。使用氮氣將樣品靶吹凈,隨后將其放入儀器中,并使用串聯飛行時間質譜儀(5800 MALDI-TOF MS/MS)進行檢測。質譜方法以及條件MALDI-TOF/TOF,激光源為YAG激光器,UA波長為355 nm,加速電壓為2000 V,采集數據的模式為正離子模式與自動獲取數據的模式,一級質譜(MS)掃描質量范圍為800～4000 Da,收集信噪比>50的母離子進行二級質譜(MS/MS)分析,每個樣品上挑選8個母離子,二級質譜累計疊加2500次,碰撞能量為2 kV。

1.3 數據處理

利用軟件Mascot distiller過濾基線峰、識別信號峰。利用Mascot軟件及Biotools軟件搜索NCBI庫,搜索IPI_Gallusgallus數據庫,尋找匹配的相關蛋白質。查詢條件為:a.物種選Gallus gallus;b.肽的分子質量在0.8～4 kDa之間;c.表觀等電點與表觀分子量的誤差范圍:無限制;d.肽片段分子量最大容許誤差為:±50 ppm;e.最小匹配肽片段數:4;f.離子選擇MH和monoisotopic;g.固定修飾和可變修飾分別為Carbamidomethy1(C)和Oxidation(M)。

2 結果與分析

2.1 蛋清SDS-PAGE圖譜

孵化至第0、6、8、10、14、16、18 d的受精蛋蛋清蛋白質,經過12%的分離膠分離后的SDS-PAGE圖譜如圖1所示。從圖1中可以得到,在前期(0～6 d),受精蛋蛋清蛋白質隨著孵化時間的增加變化不太明顯,可能由于在孵化前期蛋清蛋白質主要發揮生物活性作用,如參與免疫調節、抗微生物、保持血壓處于穩定狀態等。而從孵化至14 d后,分子量小于55 kDa蛋白條帶的灰度值隨孵化時間延長逐漸降低,這是由于孵化后期蛋清蛋白質逐漸被內源酶水解或進入蛋黃,為胚胎提供能量和營養物質[13]。另外,孵化第8 d和10 d卵清蛋白條帶明顯比第0 d灰度值高,可能由于隨著孵化時間的延長,一些小分子蛋白或蛋白質片段相互聚集形成大分子物質[10-11]。孵化至第18 d后,卵清蛋白條帶的灰度值明顯降低,可能是由于蛋清進入蛋黃或被胚胎吸收并利用[14]。另外,通過上述受精蛋蛋清蛋白質在孵化期間的變化情況,我們選取了第0、6、14和16 d作為重要的時間節點,利用MALDI-TOF MS/MS鑒定不同孵化時期受精蛋蛋清小分子多肽。

圖1 不同孵化時期受精蛋蛋清的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE analysis of egg white proteins collected from fertilized chicken eggs during incubation 注:圖上橫坐標對應分別為孵化至第0、6、8、10、14、16 和18 d的受精蛋蛋清樣品;Marker是寬分子量標準蛋白 (分子量范圍是10～170 kDa)。

2.2 MALDI-TOF MS鑒定結果

通過MALDI-TOF MS的手段鑒定不同孵化時期受精蛋蛋清小分子多肽樣品(小于10 kDa)中肽的指紋圖譜如圖2所示,圖中分別表示孵化至第0、6、14和16 d的小分子多肽指紋圖譜。孵化0 d時,小分子多肽分子量主要集中于799.0～2727.4 Da,蛋清中豐度較高的幾種小分子多肽的分子量分別為877、1042、1746和2505 Da;孵化6 d時,小分子多肽分子量主要集中于799.0～1441.8 Da,蛋清中豐度較高的幾種小分子多肽的分子量分別為822、1042、1297和1930 Da,可能是由于在孵化過程中內源酶分解蛋白質或大分子肽段而產生;孵化14 d時,小分子多肽分子量主要集中于1441.8～2084.6 Da,蛋清中豐度較高的幾種小分子多肽分子量分別為1645、1686、1901和2355 Da;孵化16 d時,分子量分布于14 d相同,蛋清中豐度較高的幾種小分子多肽分子量分別為1686、1901、2213和2350 Da,可能是蛋白質或大分子肽持續降解[13],也有可能是由于小分子多肽進入蛋黃或被胚胎吸收利用[14]。

圖2 受精蛋在不同孵化時期蛋清中小分子多肽分子量分析圖譜Fig.2 Molecular weight analysis atlas of small peptide of egg white from fertilized eggs at different days of incubation

2.3 MALDI-TOF MS/MS鑒定結果

本實驗通過MALDI-TOF MS/MS對所制取的不同孵化時期(第0、6、14、16 d)受精蛋蛋清小分子多肽樣品進行測定,最后分別在孵化第0、6、14、16 d得到837、879、872和842條肽段(共計3430條),這些肽主要來自于22種蛋白質。從表1可以得到,第0、6 d所得到的共有肽段主要來自于叢生蛋白(clusterin precursor)、一氧化氮合酶相互作用蛋白(nitric oxide synthase-interacting protein)、新城疫病毒類感染蛋白(NDV infected-like protein)以及一種未知蛋白,其中第0 d所得到特有肽段來自于跨膜蛋白14A X3亞型(transmembrane protein 14A isoform X3)、白細胞介素6(interleukin 6)和熱休克蛋白70(Hsp-70),第6 d所得到特有肽段來自于乳清酸性蛋白類似蛋白X3亞型(whey acidic protein isoform X2)和T細胞受體Vg3-Jg2(T-cell receptor gamma Vg3-Jg2)。

表1 孵化第0、6、14、16 d受精蛋蛋清中鑒定到的小分子多肽Table 1 Small peptides of egg white identified by MALDI-TOF MS/MS at 0,6,14 and 16 d of incubation

研究發現第0、6 d叢生蛋白前體肽段以較高豐度多次被檢測到,而在孵化后期未檢測到,其結果與前人的研究基本一致[11]。叢生蛋白作為一種分泌糖蛋白[15],屬于伴侶蛋白家族[16],曾多次在雞胚的某些組織中被鑒定到,包括蛋清和蛋殼[17]。另外也有學者提出雞胚可以看作閉鎖吸收的代表性材料,叢生蛋白能夠防止蛋白質聚集和沉淀,對胚胎發育過程具有重要的意義[18]。因此,孵化前期叢生蛋白豐度較高對維持蛋白質的相對穩定具有一定作用,而孵化后期叢生蛋白的降解有益于打破蛋清蛋白質的穩定系統,從而使其更容易被雞胚吸收。另一方面,第0、6 d都檢測到高豐度的新城疫病毒類感染蛋白。研究表明該蛋白與機體氧化壓力有關[19],且該蛋白過表達能夠產生更多的抗干擾素-α抗體[20]。在孵化前期大量檢測到此蛋白的存在與雞胚發育早期尚未形成完善的免疫系統,對外源性病毒的防御主要依賴蛋清蛋白質或肽的作用有關。

第0 d所得到特有的跨膜蛋白14A X3亞型的肽段,該蛋白屬于跨膜蛋白家族[21],跨膜蛋白家族成員經常在各類癌癥中異常表達?？缒さ鞍?4A是含有3個跨膜結構域的膜蛋白,研究表明跨膜蛋白14A是人類肝細胞癌變中的上調基因[22]。另有學者研究得出跨膜蛋白14A在卵巢中過表達,引起癌癥[23],即作用于細胞膜的人前膠原C端肽酶組分,在不同的器官的過表達會引起不同種類的惡性腫瘤[24]。跨膜蛋白14A在本實驗中只在孵化前期受精蛋蛋清中被檢測到,其在胚胎發育過程中可能對細胞增殖以及凋亡起調控作用需進一步研究。白細胞介素6和熱休克蛋白70僅在第0 d被檢測到,它們均屬于應激性蛋白,可能對胚胎發育過程中抵御外界不良反應起到重要作用[25]。研究表明乳清酸性蛋白類似X3亞型蛋白基因包含多個四硫化二核結構域,能夠調節肺部炎癥反應發[26],T細胞受體Vg3-Jg2只在脾淋巴細胞中表達,與胚胎脾淋巴發育有關[27]?？偟膩碚f,孵化前期檢測到的肽主要來自于某些具有抗菌抗病毒能力以及與胚胎正常發育密切相關的蛋白,這些由雞蛋自身內源酶降解的小分子多肽一方面在蛋清中發揮防御功能抵御等外界不良刺激,另一方面它們通過降解成小分子肽更加有利于被胚胎吸收合成自身的防御系統。

表1中第14、16 d所得到的共有肽段主要來自于包含cx9C基序蛋白4(motif-containing protein 4)、sprouty同源蛋白1(protein sprouty homolog)、核糖體60S L37a蛋白(60S ribosomal protein L37a)、碳酸酐酶2(carbonic anhydrase 2)和防御素A1前體(ovodefensin A1 precursor),其中第14 d所鑒定到特有肽段來自于蛋白α-Ⅰ膠原蛋白III 型(alpha-1 collagen type III)、結合甘露糖凝集素前體蛋白(mannose-binding lectin precursor)、LIM 結構域衰老細胞抗原蛋白1(LIM and senescent cell antigen-like-containing domain protein 1)和coiled-coil domain-containing protein 81-like isoform X3;第16 d所鑒定到特有的肽段來自于活性氧調節劑蛋白1(reactive oxygen species modulator 1)、溶質載體家族12成員5蛋白(solute carrier family 12 member 5-like)、垂體特異性轉錄因子(pituitary specific transcription factor)和防御素蛋白11(Gal 11)。

第14、16 d均得到大量來自于與胚胎發育呼吸作用相關蛋白的肽段,如cx9C基序蛋白、Sprouty 1蛋白和碳酸酐酶2。研究表明將雞胚暴露在CO2環境下,在孵化第二階段紅細胞中碳酸酐酶的含量和活性明顯高于普通環境,碳酸酐酶能夠調節胚胎的呼吸作用[28]。另外,Sprouty 1蛋白最早是在果蠅的遺傳基因中鑒定到,具有調控眼睛等器官發育的作用[29]。有研究者對非洲蟾蜍的Sprouty 1進行研究,發現此蛋白能夠抑制成纖維細胞表皮生長因子所引起蛋白激酶信號通路的激活,從而影響呼吸器官的正常功能[30]。cx9C基序蛋白對于呼吸鏈復合物的組裝或穩定性發揮關鍵性作用[31],此蛋白可能對雞胚生長發育過程中對其呼吸及呼吸道酶至關重要。這一系列與呼吸作用相關的肽段可能被胚胎吸收利用用于合成自身的呼吸系統。

核糖體蛋白L37a具有單個C2-C2鋅指狀基序,該蛋白質在胚胎發育中的功能是促進轉錄和蛋白質結合[32]。防御素A1前體可能與機體的免疫調節和防御功能有關。一般認為防御素具有廣譜抗菌能力,即對革蘭氏陽性菌和陰性菌都有抑菌作用,但有文獻報道雞防御素能夠對幾種大腸桿菌具有潛在的抗菌活性,當防御素濃度為0.25 μmol時能夠有效抑制大腸桿菌的生長,但對于其他菌株沒有抑制能力[33]。防御素較窄的抗菌譜推測其可能在雞胚發育過程中主要承擔的是生物學功能即保護胚胎的能力,而不僅僅是抗菌能力[34],而本實驗室在胚胎發育后期檢測到大量來自于防御素蛋白的肽段似乎也佐證了這一觀點。前人在雞蛋殼膜的厚外膜和薄內膜中的每一層均鑒定到膠原蛋白,這是由于母雞輸卵管將膠原樣物質沉積到發育中的卵表面[35]。另外也有研究證實鯰魚卵中的膠原蛋白被組裝在三維網絡結構中,形成耐久性較好的外殼,此外殼對胚胎具有保護和過濾作用[36]。本實驗在胚胎發育后期檢測到膠原蛋白肽段,是否該蛋白是從蛋殼膜轉移至蛋清后降解以供胚胎吸收利用還有待進一步驗證。甘露糖結合凝集素(MBL)是抵御病毒,寄生蟲和細菌病原體的第一道防線,是先天免疫過程中具有重要作用的C型血清凝集素蛋白[37]。有學者對雞MBL進行關于其吞噬作用和補體激活作用的研究,發現高濃度MBL血清相比低濃度MBL對金黃色葡萄球菌的殺菌作用更強,且雞MLB與哺乳動物MLB相似,都在吞噬和補體激活方面發揮重要功能[38]。coiled-coil domain-containing protein 81-like isoform X3與發育過程中免疫調節相關[39]。LIM 結構域衰老細胞抗原蛋白1可能與胚胎發育中血液運輸和調節內環境有關[40]。溶質載體家族12 成員5是K+/Cl-協同轉運蛋白,在腦部發育中具有重要作用[41]。簡而言之,在胚胎發育后期,得到大部分肽段都是來自于與胚胎發育相關的蛋白,這些肽段可能能夠協助胚胎建立自身呼吸系統和防御系統等。

3 結論

本實驗研究了不同孵化時期雞胚蛋蛋清產生的小分子多肽之間的差異,分別在孵化第0、6、14、16 d得到837、879、872和842條肽段(共3430條)。在孵化前期主要檢測到的肽來源于與抗菌抗病毒能力相關的蛋白,如類新城疫病毒蛋白、白細胞介素6、熱休克蛋白70等;而后期多是來自于與雞胚胎發育過程中呼吸和防御系統建立相關的蛋白,如Sprouty 1蛋白、碳酸酐酶2和防御素等。這些被雞蛋自身內源酶水解的肽段,有一部分會繼續發揮著其特定功能,如抗菌、抗病毒的作用;而另一部分則會被胚胎吸收利用為其建立自身呼吸系統和防御系統等提供物質基礎。本研究提供了不同孵化期間蛋清肽組學數據庫,為雞胚在孵化期間蛋清產生的小分子多肽如何參與胚胎器官發育以及系統形成等奠定理論基礎,并進一步為雞胚蛋蛋清天然活性肽提供更加開闊的前景。