甘草黃酮對大氣細顆粒物PM2.5引起肺泡巨噬細胞損傷的保護作用

熊 琪,茹 琴,張漢語,陳 琳,周 梅,田 香,李超英,*

(1.江漢大學武漢生物醫學研究院,湖北武漢 430056; 2.太和醫院臨床營養科,湖北十堰 442000)

大氣細顆粒物(PM2.5)通過干擾肺部的氣體交換,可引發肺部相關疾病的發生與發展,其主要表現在隨著PM2.5濃度的增加誘發人體呼吸系統疾病和死亡率的明顯上升[1-2]。肺泡巨噬細胞主要分布于呼吸道和肺泡表面,它是肺部重要的吞噬細胞,可首先吞噬外來顆粒物,再由溶酶體將顆粒物分解,從而減少由外來物質入侵引起的肺部損傷,因此肺泡巨噬細胞被稱為肺部抵御外來物質入侵的第一道防線[3-4]。PM2.5污染對肺泡巨噬細胞造成不同程度的損傷,如降低其吞噬功能及釋放各種炎性因子[5-6],因此研究PM2.5毒理效應及相關干預物質對肺泡巨噬細胞保護作用對降低呼吸系統疾病的發病率有重要的指導意義[7-8]。

甘草是我國珍貴的傳統中藥材,主要成分包括甘草酸、甘草次酸、黃酮等成分。甘草黃酮(licorice flavonoids)類物質是甘草中最重要的生理活性物質之一,大量研究證實其作用廣泛,主要包括抗氧化、抗炎、抗腫瘤、調節血糖作用等,因此甘草黃酮廣泛用于臨床醫藥、保健食品、食品添加劑等方面[9-13]。然而目前甘草黃酮對細顆粒物導致的呼吸系統損傷研究尚無報道,因此,本研究旨在探討甘草黃酮對細顆粒物引發的肺泡巨噬細胞損傷的保護作用,為今后細顆粒物PM2.5毒性防治工作及甘草黃酮的臨床應用提供理論依據。

本實驗以大鼠肺泡巨噬細胞(NR8383)為研究對象,細顆粒物標準品(SRM 2786)為干預物質,建立體外PM2.5染毒NR8383細胞的實驗模型,通過初步對SRM 2786引發的NR8383細胞炎性損傷和氧化應激損傷的機制研究,探討不同濃度的甘草黃酮對SRM 2786染毒后損傷NR8383細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

細顆粒物標準品SRM 2786 美國國家標準與技術研究所；大鼠肺泡巨噬細胞(NR8383) 中國科學院上海細胞庫;甘草黃酮標準品(純度為99%) 中國食品藥品檢定研究院;胎牛血清(FBS)、Kaighn’s Modification F-12K培養基、磷酸鹽緩沖液(PBS)和青鏈霉素 美國Gibco公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒、二甲基亞砜(DMSO)及2,7-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,DCFH-DA) 美國Sigma公司;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-PX)檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所;BCA蛋白測定試劑盒 武漢博士德生物有限公司;NO釋放檢測試劑盒 中國碧云天生物技術公司;熒光探針腫瘤壞死因-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)及白介素-1β(IL-1β)Elisa檢測試劑盒 美國Biosource公司。

3308 CO2培養箱、1300 Series A2超凈工作臺、Multiskan Go全波長酶標儀、Fluoroskan Ascent FL熒光酶標儀 Thermo Scientific公司;ZOETMFluorescent Cell Imager細胞成像儀 Bio-Rad Laboratories Inc.;Avanti J-26 X高速離心機 Beckman Coulter Company;DD5臺式低速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司;HH S21-4S水浴鍋 上海新苗醫療器械制造有限公司;UP-250超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細顆粒物的來源及懸液制備 本實驗所選用的細顆粒物標準品SRM 2786購于美國國家標準與技術研究所。其主要成分組成及成分分析詳見于美國國家標準與技術研究所官方網站[14]。實驗所用的SRM 2786均為現配現用,具體配制方法為將一定量的SRM 2786溶于F-12K完全培養基,配制成母液濃度為2000 μg/mL的SRM 2786儲存液,經細胞破碎儀超聲振蕩混勻后(功率為100 W,超聲破碎1 min),根據實驗室前期實驗結果[8],將其用F-12K完全培養基稀釋為125 μg/mL的SRM 2786懸液。

1.2.2 甘草黃酮溶液的配制 將甘草黃酮溶于DMSO制成母液濃度為20 mg/mL的甘草黃酮儲存液(DMSO濃度在甘草黃酮儲存液中占比小于0.5%),再依次溶于F12K完全培養基配制成不同實驗終濃度的甘草黃酮溶液,其濃度分別為1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200及400 μg/mL。

1.2.3 細胞培養 采用F-12K完全培養基(10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+0.1 mg/mL鏈霉素溶液)對NR8383細胞進行培養。NR8383細胞為半貼壁半懸浮細胞,取生長融合度為80%～90%的細胞進行如下實驗。

1.2.4 細胞活性的測定 取對數生長期的NR8383細胞(培養72 h后),將細胞接種于無菌96孔板(細胞密度為1×104cell/mL),置于37 ℃、5% CO2的培養箱24 h培養。24 h后分別將不同濃度的甘草黃酮(1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200及400 μg/mL),本實驗將NR8383細胞分為6組,分別為含F12K培養基NR8383細胞對照組、125 μg/mL SRM 2786染毒NR8383細胞模型組、及經篩選出的合適濃度的甘草黃酮給藥組(分別給予3.125、6.25、12.5、25 μg/mL,同時給予125 μg/mL SRM 2786),每組設3個復孔;同時,設置無細胞空白組(除對照組和空白組以外,其他各組均為樣本組)。37 ℃、5% CO2的培養箱繼續孵育細胞24 h培養后,光學顯微鏡下觀察細胞形態并拍照每孔,隨后每孔加入10 μL的MTT(5 mg/mL),放入培養箱繼續培養4 h后,棄上清,每孔加入200 μL DMSO混勻,充分溶解細胞形成的結晶,采用酶聯免疫檢測儀(570 nm波長)測定吸光度(A)值,計算細胞存活率(%)=(樣本組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100。

1.2.5 細胞因子含量的測定 將對數生長期的NR8383細胞用移液槍反復吹打,收集細胞,室溫1000 r/min離心6 min后將細胞接種于24孔板(細胞密度為1×105cell/mL),每孔加1 mL 溶于F12K培養基的細胞;24 h過夜培養后,棄去原F12K培養液,本實驗將NR8383細胞分為6組,分別為含F12K培養基NR8383細胞對照組、125 μg/mL SRM 2786染毒NR8383細胞模型組、及經篩選出的合適濃度的甘草黃酮給藥組(分別給予3.125、6.25、12.5、25 μg/mL,同時給予125 μg/mL SRM 2786),繼續培養24 h,每組設置3個復孔;同時,1000 r/min離心6 min后,收集各組細胞上清液,根據Elisa試劑盒說明書測定各組細胞上清液中TNF-α、IL-6及IL-1β的含量。

1.2.6 NO釋放測定 本實驗采用硝酸還原酶化學比色法測定細胞上清液NO含量[15],將對數生長期的NR8383細胞接種于24孔板(細胞密度為1×105cell/mL),每孔加1 mL 溶于F12K培養基的細胞;24 h過夜培養后,棄去原F12K培養液,本實驗將NR8383細胞分為6組,分別為含F12K培養基NR8383細胞對照組、125 μg/mL SRM 2786染毒NR8383細胞模型組、及經篩選出的合適濃度的甘草黃酮給藥組(分別給予3.125、6.25、12.5、25 μg/mL,同時給予125 μg/mL SRM 2786),繼續培養24 h,每組設置3個復孔;取各組細胞上清液50 μL,依次加入等量的Griess試劑I和Griess試劑II,利用酶聯免疫檢測儀在A540波長下測定吸光度,檢測細胞上清液中NO的含量。

1.2.7 ROS釋放測定 根據Kim實驗室[16]ROS檢測方法,用DCFH-DA熒光探針測定NR8383細胞內ROS釋放水平,NR8383細胞處理及SRM 2786染毒組和甘草黃酮給藥組的分組方式同上述實驗方法一致(1.2.5～1.2.6)。將對數生長期的NR8383細胞接種于6孔板里(細胞密度為1×106cell/mL)各組細胞以1000 r/min轉速離心6 min后,棄上清溶液,分別用PBS漂洗1次,隨后加入終濃度為100 μmol/L的DCFH-DA(500 μL/孔),放入培養箱孵育1 h后,棄上清,用PBS漂洗各孔2次,最后用1 mL PBS重懸各孔細胞,收集細胞后,熒光酶標儀在激發波長485 nm,發射波長538 nm測定條件下測定各組吸光度值,每組做三個重復。

1.2.8 細胞中SOD及GSH-PX含量的測定 將對數生長期的NR8383細胞接種于6孔板里(細胞密度為1×106cell/mL),按照上述實驗中(1.2.5～1.2.6)相同的給藥及分組方法處理各組細胞后,收集細胞,室溫下1000 r/min離心6 min,棄上清收集細胞,將300 μL PBS重懸各組細胞后,細胞超聲破碎儀冰浴裂解各組細胞(20 kHz持續5 s破碎,間隔10 s,重復三次)。裂解完成后,將各組細胞離心(4 ℃高速12000×g離心15 min)后取上清,首先利用BCA試劑盒給兩個實驗中各組細胞測定蛋白濃度,然后分別嚴格按照SOD和GSH-PX提取試劑盒說明書操作,最終測定各組細胞中SOD與GSH-PX含量,每組做3個重復。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 甘草黃酮對NR8383細胞存活率的影響

MTT結果顯示相較于對照組,當甘草黃酮濃度為3.125～25 μg/mL時,NR8383細胞存活率均有顯著上升(見圖1)(p<0.05);當甘草黃酮濃度分別為1.56、50、100、200及400 μg/mL時,細胞存活率相較于對照組均無顯著改變(p>0.05)。因此,以甘草黃酮為3.125～25 μg/mL用于以下相關實驗。

圖1 甘草黃酮對NR8383細胞存活率的影響Fig.1 Effects of licorice flavonoids on NR8383 cell survival rates注:##與對照組相比,p<0.01;*與SRM 2786組相比,p<0.05; **與SRM 2786組相比,p<0.01;圖2～圖6、表1同。

2.2 甘草黃酮對SRM 2786干預后NR8383細胞存活率的影響

如圖2所示,相較于對照組,125 μg/mL SRM 2786暴露組NR8383細胞的存活率降至56.11%±1.04%,差異極顯著(p<0.01)。與125 μg/mL SRM 2786染毒相比,125 μg/mL SRM 2786與各濃度甘草黃酮共處理NR8383細胞的存活率均明顯增高,且差異極顯著(p<0.01)。

圖2 甘草黃酮對125μg/mL SRM2786染毒NR8383細胞存活率的影響Fig.2 Effects of licorice flavonoids on NR8383 cell survival rates induced by 125 μg/mL SRM2786

2.3 甘草黃酮對SRM 2786干預后NR8383細胞形態的影響

如圖3所示,SRM 2786處理NR8383模型組,相對于對照組,細胞表面明顯有顆粒物SRM 2786附著,細胞間隙也存在大量顆粒物SRM 2786,除此之外模型組的細胞數量也顯著減少,部分貼璧NR8383細胞也呈現懸浮狀態;當加入不同濃度甘草黃酮后,相對于SRM 2786模型組,細胞數量均有顯著性提高,且NR8383細胞貼璧數量變多,其次細胞間隙較為干凈,表明甘草黃酮可促進NR8383細胞的吞噬作用清除部分顆粒物SRM 2786,從而提高細胞存活率,使細胞數目相較于模型組有了顯著提高。此結果與本文中甘草黃酮對SRM 2786干預后NR8383細胞存活率的影響的結果也較為一致。

圖3 NR8383細胞在SRM2786及甘草黃酮處理下的生長形態(100×)Fig.3 Growth morphology of NR8383 cells treated by SRM 2786 and licorice flavonoids(100×)

2.4 甘草黃酮對SRM 2786干預后NR8383細胞炎癥因子釋放的影響

顆粒物引發的細胞炎性損傷是參與細胞毒性損傷的重要機制之一[17]。管燕等[18]研究發現甘草黃酮對脂多糖誘導的小鼠肺部急性炎癥有良好的保護作用。本研究首次探討甘草黃酮對SRM 2786染毒后NR8383細胞的相關炎性因子釋放的影響。表1中,與對照組相比,125 μg/mL SRM 2786處理NR8383模型組細胞上清液中的炎癥因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)含量均上升,且差異極顯著(p<0.01)。與125 μg/mL SRM 2786模型組比較,125 μg/mL SRM 2786與各濃度甘草黃酮共處理NR8383細胞上清液中的TNF-α、IL-6和IL-1β含量均顯著降低,且差異均為極顯著(p<0.01)。

表1 甘草黃酮對SRM2786染毒NR8383細胞釋放炎癥因子的影響Table 1 Effects of licorice flavonoids on cytokine release induced by SRM2786 in NR8383

2.5 甘草黃酮對SRM 2786干預后NR8383細胞NO含量釋放的影響

NO及其相關化合物不僅可以直接氧化內源抗氧化劑,還對過氧化氫酶等抗氧化性酶的活力有抑制作用,從而引發細胞氧化損傷[19-20]。NO是體內一種反應性極強的自由基,具有廣泛的生理作用如圖3所示,與對照組相比,125 μg/mL SRM 2786處理NR8383模型組細胞上清液中的NO釋放有顯著上升,且差異極顯著(p<0.01)。然而125 μg/mL SRM 2786模型組與各濃度甘草黃酮共處理NR8383細胞上清液中的NO釋放相較于125 μg/mL SRM 2786模型組均有降低,且當甘草黃酮濃度為6.25～12.5 μg/mL時,其差異顯著(p<0.05),當甘草黃酮濃度為25 mg/mL時，其差異極顯著(p<0.01)。

圖4 不同濃度甘草黃酮與125μg/mL SRM2786對NR8383細胞NO釋放影響Fig.4 The combined effect of different concentrations of licorice flavonoids and 125 μg/mL SRM 2786 on NO production in NR8383 cells

2.6 甘草黃酮對SRM 2786干預后NR8383細胞ROS含量釋放的影響

如圖5所示,相對于對照組,SRM 2786干預NR8383細胞模型組的ROS含量有了極顯著提高(p<0.01),且隨著甘草黃酮濃度的增加,NR8383細胞ROS含量的釋放相對于SRM 2786模型組亦有極顯著下降(p<0.01)。

圖5 不同濃度甘草黃酮與125μg/mL SRM2786對NR8383細胞ROS釋放影響Fig.5 The combined effect of different concentrations of licorice flavonoids and 125 μg/mL SRM 2786 on ROS production in NR8383 cells

2.7 甘草黃酮對SRM 2786干預后NR8383細胞SOD活性和GSH-PX含量的影響

抗氧化酶(SOD和GSH-PX)能夠有效抑制機體氧化作用,減少體內自由基堆積[21]。甘草黃酮對SRM 2786誘導NR8383細胞氧化應激相關酶活性如圖6所示,SRM 2786模型組的SOD活性和GSH-PX含量相較于對照組有極顯著降低(p<0.01);相較于SRM 2786模型組,不同濃度的甘草黃酮可以顯著(p<0.05或極顯著p<0.01)提高由SRM 2786導致NR8383細胞下降的SOD活性及GSH-PX含量。

圖6 不同濃度甘草黃酮與125μg/mL SRM2786對NR8383細胞SOD活性和GSH-PX含量的影響Fig.6 The combined effect of different concentrations of licorice flavonoids and 125 μg/mL SRM 2786 on SOD activities and GSH-PX contents in NR8383 cells

3 討論與結論

研究證實,長期生活在高濃度的細顆粒物PM2.5的環境可能與肺炎及肺癌導致的死亡風險上升有關[22-23]。肺泡巨噬細胞不僅可用來準確評價細顆粒物毒性[24],也可用來研究如何降低細顆粒物對其損傷,從而對改善人體自身免疫力有重大意義。本實驗室前期結果顯示,細顆粒物標準品SRM 2786可使NR8383細胞線粒體發生機能紊亂及細胞凋亡,最終導致NR8383細胞的毒性損傷[25-27]。本實驗結果顯示SRM 2786染毒可顯著降低NR8383細胞存活率、顯著增加炎癥因子釋放(TNF-α、IL-6及IL-β)和氧化應激相關ROS及NO的釋放,同時細胞中SOD活性和GSH-PX含量顯著降低,因此進一步證實SRM 2786可通過氧化損傷和炎性損傷引起NR8383細胞毒性損傷。

黃酮類物質可顯著改善肺間質纖維化的肺功能指標,同時對急性肺損傷也有顯著保護作用[28-30]。王存良等[31]的動物實驗證實甘草黃酮可通過增加肝癌荷瘤小鼠免疫細胞的數量而明顯抑制腫瘤,然而甘草黃酮對肺泡巨噬細胞的影響目前尚無報道。因此,本研究主要探討甘草黃酮對SRM 2786染毒后的NR8383細胞存活率、炎性損傷及氧化應激的影響。實驗證實甘草黃酮可顯著增加由SRM 2786導致降低的細胞存活率、顯著降低ROS和NO釋放及顯著增加細胞SOD活性和GSH-PX含量,因此說明甘草黃酮通過降低細胞炎性損傷和氧化損傷對SRM 2786引起的NR8383細胞毒性損傷具有一定保護作用。

綜上所述,本研究發現甘草黃酮對細顆粒物PM2.5引起的肺泡巨噬細胞損傷有保護作用,主要表現在提高細胞存活率、減少炎性因子(TNF-α、IL-6 和 IL-1β)、降低ROS和NO釋放及增加細胞SOD活性和GSH-PX含量。其作用機制可能與抑制炎性損傷與氧化損傷相關,今后將對甘草黃酮的相關藥理作用進一步深入研究,為其在細顆粒物損傷肺泡巨噬細胞的防治研究及富含甘草黃酮的相關新功能食品的開發提供實驗理論依據。