無機硒在干酪乳桿菌和啤酒酵母混合發酵過程中的相互作用

王 琨,馬成杰,*,胡家勇

(1.光明乳業股份有限公司乳業研究院,上海 200436; 2.湖北省食品質量安全監督檢驗研究院,湖北武漢 430023)

硒元素是動物體必需的14大微量營養元素之一,具有抗癌抗氧化、調壓保肝、提高機體免疫力的作用,同時其是硫氧還蛋白還原酶、谷胱甘肽過氧化氫酶等多種蛋白的必需組成部分[1-2]。硒元素的缺乏會引起克山病、大骨節病;然而過量的硒會導致機體中毒,內分泌系統損傷,并抑制生長激素和甲狀腺激素合成[3-4]。中國72%以上屬于缺硒地區,每人每天日攝入量低于世界衛生組織推薦的最低攝入量50 μg[5]。硒元素在自然界中主要以無機硒和植物活性硒的形態存在,在生物體內不能長期貯存,需要從飲食中攝取來維持平衡[6-7]。傳統上是通過無機硒化合物即亞硒酸鈉的口服制劑補硒,但其毒副作用強,吸收利用率較低,而生物轉化后的有機硒化合物毒性低,并且能夠更好地激發機體的免疫作用[8-9]。酵母被認為是富集硒元素的最理想微生物,可以在代謝活動中將無機硒轉化為有機或無毒單質形式,且酵母本身含有蛋白質、糖類以及B族維生素等豐富的營養物質,在國外是常規的膳食補充劑[2]。

大量學者對于乳酸菌的富硒能力進行了研究,如鼠李糖乳桿菌、青春雙歧桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌等[1-2,7]。對于富硒酸奶的研究相對較少:鄭文瑋等[10]以富硒酵母為原料來加工酸乳,但富硒酵母本身即為保健產品,用于工業生產成本較高;張蓉等[4]和劉東等[11]通過制備富硒的酸奶發酵劑,進一步制作富硒酸奶,而發酵劑的添加量限制了產品的硒含量,且工序較為復雜。目前還沒有利用益生菌直接發酵含有無機硒的牛乳的相關報道。

乳制品已成為人們日常飲食的一部分,經過發酵后的乳制品不僅能夠將益生菌帶入人體內環境,同時添加的功能性物質也能夠進入人體起到保健作用。本實驗將富硒能力強的啤酒酵母與干酪乳桿菌相結合，使益生菌在發酵過程中直接利用無機硒,探究不同硒濃度與二者混合發酵復原乳的相互作用,測定發酵產品的抗氧化能力變化,并且對混合發酵過程中無機硒的轉化水平進行檢測,以期將乳制品與硒劑相結合,為開發有效并且方便的硒補充劑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪乳桿菌LC2W(CGMCC No.0828) 光明乳業研究院;啤酒酵母 安琪酵母股份有限公司;瓊脂、蛋白胨、酵母粉 OXIOD有限公司;脫脂乳粉 恒天然有限公司;亞硒酸鈉、DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、Trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic aci,6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸)、吐溫-80 SIGMA有限公司;MnSO4·H20、MgSO4·7H20、K2HPO4·3H20、乙酸鈉、檸檬酸二銨、牛肉粉、葡萄糖、氫氧化鈉、乙醇 國藥集團;硝酸 Merck公司;超純水(MQ水) 自制;YPD培養基、MRS培養基自行配制[2,7]。

RW20攪拌器 德國IKA;Bugbox厭氧工作站 英國Ruskinn;MIR-253恒溫培養箱 日本三洋;UV-1800紫外可見分光光度計 日本島津;YX-280D高壓蒸汽滅菌鍋 合肥華泰;超凈工作臺 美國Labconco;8800 ICP-MS/MS電感耦合等離子體質譜儀 安捷倫;FE20K pH計、ME203/02電子天平、ME2002E/02電子天平梅特勒-托利多儀器 (上海)有限公司;優普UPT-I-5超純水機 西安優普儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 復原乳的制備 將脫脂乳粉溶解在蒸餾水中,攪拌混合均勻,配制成12%(w/w)濃度,分裝100 mL于150 mL三角瓶中,置于高壓蒸汽滅菌鍋內115 ℃滅菌5 min,冷卻備用。測定pH為6.50。

1.2.2 菌種活化 根據王剛及曾議霆的試驗方法[7,12]稍作改動。干酪乳桿菌種子液制備:將干酪乳桿菌凍干粉用5 mL 餾水溶解,用接種環劃線于MRS固體培養基37 ℃厭氧培養24 h,用接種環挑取單菌落放入5 mL MRS液體培養基活化,37 ℃厭氧培養12 h。吸取0.2 mL活化后的菌液置于100 mL MRS液體培養基中擴大培養,37 ℃厭氧培養24 h。菌液于8000 r/min、4 ℃離心10 min,棄去上清,菌體用無菌生理鹽水洗滌2次后,用無菌生理鹽水調節菌體濃度至OD600=0.7,種子液濃度約為108CFU/mL備用。

啤酒酵母種子液的制備[2,8]:將啤酒酵母的凍干粉分別用5 mL無菌蒸餾水溶解,用接種環取一環劃線于YPD固體培養基上,30 ℃厭氧培養24 h取出,用接種環挑取單菌落放入5 mL YPD液體培養基,30 ℃厭氧培養12 h。吸取0.2 mL活化后的菌液置于100 mL MRS液體培養基中擴培,30 ℃厭氧培養24 h。菌液于8000 r/min、4 ℃離心10 min,棄去上清,菌體用無菌生理鹽水洗滌2次后,用無菌生理鹽水調節菌體濃度至OD600=0.1,種子液濃度約為106CFU/mL備用。

1.2.3 硒發酵液的配制及發酵 根據曾紅等[13]的試驗方法做改動。在滅菌后的復原乳中加入亞硒酸鈉溶液,震蕩使其充分混合,使得亞硒酸鈉的終濃度分別為0.0、2.0、5.0、10.0 mg/L。

將四種濃度的發酵液分別接種干酪乳桿菌和酵母菌種子液,使得終濃度分別為107和105CFU/mL。置于37 ℃恒溫培養箱厭氧發酵12、24、36、48 h并于各時間點取樣后冷卻至10 ℃以下備用。

1.2.4 pH檢測 用pH計檢測各組樣品在12、24、36、48 h的pH。

1.2.5 益生菌數量檢測 根據Li等[14]的試驗方法,將發酵好的加不同硒含量的發酵組及對照組混合均勻后分別準確稱取1 g,用無菌生理鹽水梯度稀釋至適宜濃度,分別用MRS和YPD培養基進行平板傾注法計數,凝固后分別置于37 ℃恒溫培養48 h,每組做三個平行,分別測定12、24、36、48 h的菌數,每組做三個平行,將平均值以10為底取對數作圖。

1.2.6 硒轉化率的檢測 參考劉嘉坤等[15]和曾議霆等[7]的試驗方法,并且稍作改動。微波消解:準確稱取約0.4000 g試樣于聚四氟乙烯消解管中,加10 mL硝酸進行微波消解。微波消解程序設置如下:溫度爬坡10 min升溫至120 ℃,溫度保持5 min;溫度爬坡10 min升溫至190 ℃,保持20 min;冷卻25 min降溫至55 ℃。冷卻后取出,緩慢打開罐蓋排氣,將消解罐放在控溫電熱板上或超聲水浴箱中,于100 ℃加熱30 min或30 ℃ 4000 W超聲脫氣2～5 min,用超純水定容至25或50 mL,混勻備用,同時用超純水做空白試驗。

儀器條件:射頻功率為1500 W;等離子體氣流量15 L/min;載氣量0.8 L/min;輔助氣流量0.40 L/min;霧化室溫度2 ℃樣品提升速率0.3 r/s;采樣深度8～10 nm;重復三次。

別稀釋標準硒溶液至4、8、12、16、20 μg/L,依次上機測定,采用內標法定量,儀器自動完成校正曲線。將各時間點的發酵液離心取上清液,分別用0.22 μm濾膜過濾,過濾好的上清樣品按照以上測定方法上機進行測定,儀器根據校正曲線自動給出硒含量。將各時間點的發酵液離心取上清液,分別用0.22 μm濾膜過濾,過濾好的上清樣品上機后利用校正曲線進行含量測定。轉化的硒含量通過發酵前原料液的硒含量減去上清中無機硒含量獲得,即

轉化率(%)=(1-上清中硒含量/硒添加量)×100

1.2.7 抗氧化性檢測 參考Li等[14]稍做改動,將各時間點加硒組及對照組分別經10000 r/min、4 ℃離心10 min,上清用0.22 μm濾膜無菌過濾器過濾備用。取0.1 mL待測加硒組及對照組樣品于3.9 mL DPPH溶液中(DPPH母液10稀釋倍),混合均勻后室溫下避光反應30 min,以無水乙醇調零,在517 nm波長下測定吸光度A1,以無水乙醇代替樣品作為空白組測定吸光度A0,DPPH清除率計算如下:

清除率(%)=(1-A1/A0)×100

將Trolox標準溶液梯度稀釋為5、10、20、40 mg Trolox/L溶液,以Trolox濃度為橫坐標,清除率為縱坐標做清除率標準曲線,并得到半清除率(IC50)所對應的Trolox值。將各組發酵液以及過濾除菌后的上清液分別按照上述方法測得IC50,用Trolox當量(Trolox E-quivalent Antioxidant Capacity,TEAC,即每克抗氧化物質的自由基清除能力相當于Trolox的值)衡量各組樣品的抗氧化性。

1.3 數據處理

圖中數據采用Excel 2007進行處理，每組做三次平行，表示為均值±標準差，同時應用SPSS 20.0統計軟件進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 亞硒酸鈉和發酵時間對發酵液pH的影響

如圖1所示,隨著發酵時間延長,發酵液的pH均逐步下降,相同發酵時間內不同硒濃度的pH無顯著差異。說明亞硒酸鈉的添加對干酪乳桿菌和酵母菌產酸能力的抑制作用不明顯。

圖1 亞硒酸鈉濃度和發酵時間對pH的影響Fig.1 Effects of different concentration of sodium selenite and fermented time on pH注:不同字母表示顯著差異(p<0.05);圖5同。

2.2 亞硒酸鈉和發酵時間對益生菌數量的影響

如圖2所示,不同硒添加量的發酵液中干酪乳桿菌數量隨發酵時間延長呈現先增后降的趨勢,菌數均在36 h達到峰值,硒添加量從低到高的菌數分別為4.27×109、3.06×109、2.84×109、2.25×109CFU/g,未添加硒元素的發酵液中干酪乳桿菌數量高于添加硒元素的發酵液,而隨著硒劑濃度的升高,對干酪乳桿菌的增殖起到了明顯的抑制作用。在朱俊辰[16]研究表明嗜酸乳桿菌在添加亞硒酸鈉后生長緩慢,延滯期變長,對數期縮短,且未添加亞硒酸鈉的菌數量均高于硒劑組,與本實驗結果相同。而燕衛東[17]對保加利亞乳桿菌對硒耐受能力的實驗中發現,4 mg/L的亞硒酸鈉對菌種增殖有促進作用。

如圖3所示,啤酒酵母菌數亦呈現先增后降的趨勢,10 mg/kg亞硒酸鈉的發酵液在24 h達到峰值;其他各組均在12 h達到峰值,其中2 mg/kg硒酸鈉的發酵液高于其他各組,可見2 mg/kg亞硒酸鈉對酵母菌的增殖有促進作用。

圖3 亞硒酸鈉濃度和發酵時間對酵母菌數量數量的影響Fig.3 Effects of concentration of sodium selenite and fermentation time on Saccharomyces cerevisiaecount

2.3 發酵液的硒轉化率檢測

未添加硒元素的上清中硒含量為0,添加硒元素的發酵液隨著發酵時間延長上清中硒含量不斷降低在發酵24 h內,發酵液硒轉化率較快,24 h以后達到98%以上并趨于平緩(圖4)。在0～12 h之間,2 mg/kg劑量組轉化最快,其次是5 mg/kg亞硒酸鈉的發酵液。在12～24 h之間,10 mg/kg亞硒酸鈉的發酵液轉化率變快,超越了其他兩組。

圖4 加硒組的硒轉化率Fig.4 Selenite conversion rate of selenium added groups

2.4 亞硒酸鈉添加量和發酵時間對發酵液抗氧化能力的影響

如圖5A所示,隨亞硒酸鈉添加量的增加,相同發酵時間下各實驗組上清液抗氧化能力逐漸減弱,發酵24 h時,相較無外源添加硒元素發酵液,其他各組上清液的抗氧化能力隨硒濃度升高而顯著降低;發酵36 h時,除10 mg/kg亞硒酸鈉添加量的發酵液的上清液外,其抗氧化能力無顯著差異;48 h時實驗組上清液抗氧化能力無顯著差異。硒劑添加組在24 h上清抗氧化性比未添加組)顯著下降,未添加硒元素的上清液抗氧化性均維持在較高水平,24 h后出現小幅下降。研究表明乳酸菌菌體、胞內物質及胞外代謝產物(如胞外多糖),均有一定的抗氧化性[18-19]。結合2.2結果分析,無外源添加硒元素干酪乳桿菌增殖快,胞外代謝產物積累速率高,使得其上清中的抗氧化性維持在較高水平,添加硒元素之后菌數增殖慢,但在24 h前菌株對硒元素轉化率高,使得上清液中的硒含量降低的,因此24 h時上清的抗氧化性降低;48 h的菌數逐漸降低,上清中有害代謝產物積累,抗氧化性下降。

圖5 亞硒酸鈉和發酵時間對抗氧化能力的影響Fig.5 Effects of co ncentration of sodium selenite and fermentation time on antioxidant ability 注:A:上清液的抗氧化能力;B:總抗氧化能力; C:除去上清后干物質抗氧化能力。

如圖5B,隨發酵時間延長,除添加10 mg/kg亞硒酸鈉的發酵液外,總抗氧化能力不斷升高;在相同發酵時間內,亞硒酸鈉低添加量(2 mg/kg)的發酵液抗氧化能力顯著低于高添加量(5、10 mg/kg),可見亞硒酸鈉的添加增加了發酵液的抗氧化能力。

將總抗氧化能力與上清液抗氧化能力做差值得到干物質的抗氧化能力(圖5C),即排除上清中未被轉化的亞硒酸鈉,可見干物質的抗氧化能力隨硒添加量升高而上升,且添加亞硒酸鈉的發酵液抗氧化能力主要來源于發酵后的干物質,而未添加亞硒酸鈉的發酵液上清液的抗氧化能力達到50%以上。由于發酵液中的亞硒酸鈉被微生物轉化利用,轉化為有機硒或單質硒,使得發酵乳干物質的抗氧化能力顯著提高。

3 結論

本研究以添加無機硒的復原乳為原料,利用啤酒酵母和干酪乳桿菌協同發酵,研究發現不同濃度的亞硒酸鈉在相同發酵時間內對干酪乳桿菌產酸能力的抑制作用不顯著,而對干酪乳桿菌的增殖有一定的抑制作用,且濃度越高,抑制作用越明顯。其對啤酒酵母的增殖并無顯著抑制,相反,2 mg/kg的亞硒酸鈉對啤酒酵母的增殖產生了促進作用。在發酵過程中,亞硒酸鈉的生物轉化率在發酵前24 h不斷升高,之后趨于平穩,其中2 mg/kg劑量組轉化最快;隨亞硒酸鈉濃度不斷增加,其抗氧化能力不斷提高,發酵乳的總抗氧化能力和除去上清的固體物質抗氧化能力均不斷上升。綜合考慮pH,益生菌數量以及硒轉化率結果,在添加2 mg/kg的亞硒酸鈉發酵24 h時,發酵乳性能較好。本研究為含硒的功能性乳品的開發提供了一定的理論基礎。