NaCl和pH對普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌碳源代謝能力的影響

單 珂,郭全友,李保國

(1.上海理工大學醫療器械與食品學院,上海 200093; 2.中國水產科學研究院東海水產研究所,上海 200090)

水產品由于水分和蛋白質含量高等特點,極易在貯運期間發生腐敗。研究表明,水產品中的特定腐敗菌(Specific spoilage organism,SSO)是導致水產品腐敗變質的主因,SSO能分解糖類、蛋白質、脂肪等,通過代謝產生小分子物質,生成難聞的異味,縮短產品貨架期和流通半徑[1-2]。微生物不斷從外界吸收碳源、氮源、無機鹽和微量元素等營養物質,維持自身生長[3]。在pH、溫度、鹽分、水分活度和抑菌劑等脅迫作用下,微生物通過不斷消耗能量來維持內部平衡,若超出其耐受范圍,可導致細菌死亡[4]。從能量代謝角度分析不同脅迫條件下微生物生長狀況,對于研發食品保藏和安全控制具有重要意義。微生物代謝分析方法主要有核磁共振技術[5]、微量量熱法[6]和微生物培養法[7]等。在維持微生物生長的要素中,碳源是維持微生物生長的重要能源,不但對菌株生長起重要作用,對其胞內酶的合成有選擇性誘導作用,同時還是生物體代謝的底物,其存在種類和數量對微生物生長極其重要[8]。此外,碳源還在微生物的許多生理代謝過程中扮演著調節因子的角色,且存在復雜的碳源感應系統[9]。因此,研究環境脅迫下微生物碳源代謝及動力學,對于采用靶向抑菌技術延長產品貨架期具有重要意義。

BIOLOG技術是研究微生物碳代謝特征的有效方法之一,通過微生物對底物代謝形成可識別代謝指紋,分析微生物對單一碳源的代謝能力,具有方便省時的特點[10]。微生物不同,其利用的優勢碳源也存在差異,如假單胞菌的優勢碳源是有機酸和氨基酸[11],葡萄糖是大腸桿菌的優勢碳源[12]。環境因子的改變也會改變微生物對碳源的利用效果[13],同時微生物存在碳代謝抑制(Carbon catabolite repression,CCR)機制[14],有助于微生物針對環境條件變化做出應激響應,并進行自我調整,從而提高競爭力,此種機制在不同物種間存在差異[15]。輕腌大黃魚是一種主要大黃魚加工品,具有低鹽、水分高和弱酸的特點,腐敗菌極易繁殖,導致產品腐敗和貨架期較短。課題組前期在對輕腌大黃魚低溫(5 ℃)貯藏過程品質和貨架期終點菌相進行研究的基礎上,分離出普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌兩種優勢菌。雖已對低溫(5 ℃)和室溫(25 ℃)下普通變形桿菌的碳源代謝能力進行研究[16],但輕腌大黃魚主要抑菌因子(NaCl和pH)對優勢菌碳源代謝的影響少見報道。

本文以源自輕腌大黃魚的優勢菌普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌為對象,使用BIOLOG GENⅢ微孔板培養法,測定不同NaCl和pH脅迫作用下其生長狀況及71種碳源代謝能力的差異性,旨在為靶向抑制腐敗菌生長、優化產品配方,深入探究環境因子與其代謝機制的關系提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株來源:5 ℃下輕腌大黃魚儲藏29 d到達貨架期終點,終點菌相經MIDI氣相鑒定儀及16S rRNA測序,確定其優勢菌株為普通變形桿菌(Proteusvulgaris)(序列號:KY684257)和蜂房哈弗尼菌(Hafniaalvei)(序列號:KY684258),比例分別為58.9%和35.9%[17],菌株-80 ℃冰箱凍藏,用前活化備用。營養瓊脂培養基(BR)、營養肉湯培養基(BR)、氯化鈉(AR)、NaOH(AR)、HCl(AR) 上海市國藥集團化學試劑有限公司;Biolog IF-A接種液、Biolog GENⅢ板 美國Biolog公司。

MIR-153型高精密度低溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;SW-CJ-1FB型超凈臺上海博迅實業有限公司醫療設備廠;pHS-3C型pH測定儀 上海儀電科學儀器股份有限公司;YXQ.SG41.280A型手提式壓力蒸汽滅菌鍋上海醫用核子儀器廠;Biolog GEN3微生物半自動鑒定儀美國Biolog公司;DW-86L626型超低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 接種設計 基于輕腌大黃魚低鹽(鹽分<6%)和pH近中性的特點[18],將BIOLOGIF-A接種液按設置的濃度梯度調節到相應水平,分別為NaCl:1%、2%、3%、4%和5%(各組別pH均為7.0),pH:5.0、5.5、6.0、6.5和7.0(不含NaCl),其中,pH為7.0組即為對照組。用接種環蘸取保藏的普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌菌液分別接種于營養肉湯培養基中,25 ℃培養24 h得到活化的菌液,之后用接種環在營養瓊脂平板上劃線,25 ℃培養24 h得到單菌落,參照BIOLOG GEN Ⅲ板操作說明,用接菌棒挑取菌落至IF-A接種液中,上下滑動使得菌體分散,將菌懸液濃度調至90%～98%,用八通道電動移液器將菌懸液加入到GEN Ⅲ微孔板中,5 ℃恒溫培養,采用OmniLog讀數儀讀取數據,每隔12 h測一次吸光度(OD590 nm),共10 d。

1.2.2 碳源利用能力的測定

1.2.2.1 豐富度指數的計算 豐富度指數(Number of positive wells)是指菌株總的碳源利用種數,即Ci-R>0.25的孔數,Ci為除對照孔外各孔的OD590 nm值,R為對照孔OD590 nm值[19]。

1.2.2.2 平均顏色變化率的計算 用每孔平均顏色變化率(Average well color development,AWCD)來表示微生物對不同碳源的代謝能力,可描述微生物代謝強度及平均活性,顏色變化的深淺即代表該種碳源的利用強弱,代表各孔的平均顏色響應[20]。公式為:

式(1)

式中:R為對照孔OD590 nm值;C為含有碳源孔OD590 nm值;n為碳源孔數。

1.2.2.3 不同種類碳源利用能力分析 BIOLOGGENⅢ板內包含71種碳源,參照董秀黃[21]的分類方法將其分為6大類,分別為:糖類31種、氨基酸類10種、羧酸類15種、己糖磷酸類8種、酯類3種、其他類4種。

對不同種類碳源的利用能力以利用積分面積S表示,按照碳源分類分別計算,碳源利用面積公式為[4]:

式(2)

式中:Vti為ti時的OD590 nm值。

1.3 數據處理

數據采用軟件Microsoft Excel和IBMSPSS Statistics20(美國IBM公司)進行分析處理,主成分分析(Principal component analysis,PCA)采用SPSS進行,采用Origin 9(美國Origin Lab公司)軟件對數據進行作圖。采用獨立樣本T檢驗和單因素ANOVA分析方法進行差異顯著性檢驗(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 NaCl濃度和pH對菌株碳源代謝豐富度指數的影響

利用豐富度指數來表示微生物能夠代謝的碳源總種數,NaCl濃度和pH對兩株菌碳源利用豐富度指數變化的影響如圖1～圖2所示。

圖1 NaCl濃度對兩株菌碳源代謝豐富度指數影響Fig.1 Effect of NaCl concentration on basis number of positive wells of carbon source metabolism of the two strains注:圖中顯著性表示同一NaCl或pH下兩株菌 之間的顯著性差異比較,相同字母代表無顯著性差異, 不同字母代表差異顯著(p<0.05);圖2同。

圖2 pH對兩株菌碳源代謝豐富度指數影響Fig.2 Effect of pH on basis number of positive wells of carbon source metabolism of the two strains

由圖1可知,NaCl濃度對普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌豐富度指數的影響趨勢相同,隨著NaCl濃度的增加均呈下降趨勢,NaCl濃度為0時,兩株菌能利用的碳源種類最多,均為23種;當NaCl濃度增加到3%時,豐富度指數急劇下降到0,表明此時NaCl已抑制了兩種微生物的碳源代謝。NaCl濃度為0～1%時兩株菌之間無顯著差異,NaCl濃度為2%時,蜂房哈弗尼菌豐富度指數大于普通變形桿菌,差異顯著(p>0.05),NaCl>3%時,兩株菌的生長受到強烈抑制,豐富度指數為0。

由圖2可知,當pH為5.0時,普通變形桿菌只能利用13種碳源,蜂房哈弗尼菌能利用28種碳源,隨著pH的升高,普通變形桿菌的豐富度指數呈上升趨勢,蜂房哈弗尼菌則總體變化不大,在pH為7.0時,普通變形桿菌能利用23種碳源,蜂房哈弗尼菌能利用26種碳源。此結果表明,低酸環境能在一定程度上抑制普通變形桿菌生長,與曹海軍等[22]的研究結果趨勢相同,普通變形桿菌在pH4.0～5.5生長緩慢;蜂房哈弗尼菌則受pH影響不大,甘未祺[23]研究了pH對蜂房哈弗尼菌群體感應信號分子基因表達的影響,發現在pH5.0、6.0和7.0之間無顯著性差異,與本文結果相對應。由此可知,蜂房哈弗尼菌對低pH的耐受性高于普通變形桿菌。

2.2 NaCl濃度和pH對菌株平均顏色變化率的影響

探究不同壓力條件下菌株對于碳源的總體代謝能力,利用平均顏色變化率AWCD來衡量其變化趨勢[24],不同NaCl和pH條件下普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌總體碳源代謝的AWCD變化曲線見圖3～圖6。

圖3 普通變形桿菌在不同NaCl濃度下總體碳源代謝情況Fig.3 Carbon metabolism of Proteus vulgaris under different concentration of NaCl

圖6 蜂房哈弗尼菌在不同pH下總體碳源代謝情況Fig.6 Carbon metabolism of Hafnia alvei under different pH values

由圖3～圖6可知,隨著時間的變化總體碳源利用呈“S”形曲線,兩株菌的總體變化趨勢相近,NaCl對兩種腐敗菌的總體碳源代謝能力影響更大。圖3為NaCl濃度對普通變形桿菌碳源代謝的影響,與對照組相比,普通變形桿菌碳源代謝能力隨著NaCl濃度的升高,抑制效果逐漸增加,當NaCl濃度為1%～2%時,細菌的延滯期較短,約為40 h,NaCl濃度升至3%時,兩株菌的生長受到明顯抑制,延滯期明顯延長,在5%條件下幾乎停止生長,AWCD值接近0。圖5為NaCl濃度對蜂房哈弗尼菌碳源代謝的影響,趨勢與圖3普通變形桿菌相似,隨著NaCl濃度的增大,碳源代謝能力下降,延滯期延長,5% NaCl濃度下AWCD值接近0,延滯期約為120 h。孔西曼等[25]研究了不同濃度NaCl對蜂房哈弗尼菌分泌信號分子AHLs的影響,在3%的NaCl濃度下蜂房哈弗尼菌的生長受到了嚴重抑制,NaCl濃度為4%、5%時,均未出現細菌生長,此結果與本研究相同。

圖5 蜂房哈弗尼菌在不同NaCl濃度下總體碳源代謝情況Fig.5 Carbon metabolism of Hafnia alvei under different concentration of NaCl

圖4和圖6顯示,pH的變化對兩株菌的影響小于NaCl,隨著pH的下降,普通變形桿菌的碳源代謝能力受到一定程度抑制,但在pH下降到5.0時依然能夠生長,AWCD值達到0.147;pH的變化對蜂房哈弗尼菌的碳源代謝能力影響稍小于普通變形桿菌,在pH為5.0時其AWCD值達到了0.2,高于普通變形桿菌。郭全友等[4]研究pH對魚源莓實假單胞菌生長的影響發現,15 ℃時pH5.0和6.0最大比生長速率比較接近,25 ℃時pH6.0的最大比生長速率遠大于pH5.0,33 ℃時兩個pH則對菌的生長起抑制作用,表明溫度也會影響細菌對pH的耐受性。

圖4 普通變形桿菌在不同pH下總體碳源代謝情況Fig.4 Carbon metabolism of Proteus vulgaris under different pH values

2.3 NaCl濃度和pH對菌株不同類型碳源利用面積的影響

圖7～圖10為兩株菌在不同NaCl和pH脅迫下對不同種類碳源利用面積的變化趨勢比較,由圖7～圖10可知,在不同NaCl和pH脅迫條件下,兩種腐敗菌對糖類的利用能力最高,其次為羧酸類、氨基酸類和己糖磷酸類,其中糖類物質的利用受影響最大,說明糖類物質是維持兩株菌生長的主要能源。兩株菌能夠利用的碳源相似,其中糖類物質主要包括:D-麥芽糖、D-海藻糖、龍膽二糖、N-乙酰-D-葡糖胺、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰神經氨酸、α-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、L-果糖、L-鼠李糖、肌苷和D-甘露糖醇;氨基酸類包括D-絲氨酸、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-谷氨酸、L-組胺、L-絲氨酸;羧酸類包括P-羥基-苯乙酸、L乳酸、L-蘋果酸和乙酸;己糖磷酸類包括D-半乳糖醛酸、D-葡糖酸和D-葡糖醛酸。

圖7 NaCl濃度對普通變形桿菌不同種類碳源利用面積的影響Fig.7 Effect of NaCl concentration on utilization area of different carbon sources of Proteus vulgaris

圖10 pH對蜂房哈弗尼菌不同種類碳源利用面積的影響Fig.10 Effect of pH values on utilization area of different carbon sources of Hafnia alvei

圖7～圖8可知,隨著NaCl濃度的增加,普通變形桿菌的碳源利用面積呈下降趨勢,1% NaCl濃度下與空白相比相差不大,NaCl濃度升高到2%時,各類碳源利用面積下降較多。以糖類、氨基酸類和羧酸類為例,由1% NaCl濃度下的1366.80±0.15、431.41±0.17和507.84±0.34分別下降到了826.33±0.22、258.92±0.25和333.22±0.37。pH的變化對兩株菌的各類碳源利用面積影響不大,pH為7.0時,糖類、氨基酸類和羧酸類的利用面積分別為1399.39±0.81、453.13±0.25和528.40±0.44,pH為5.0時,糖類、氨基酸類和羧酸類的利用面積分別為1360.57±0.63、495.90±0.51和455.20±0.42。在相同pH下,普通變形桿菌不同碳源的利用面積稍小于蜂房哈弗尼菌。

圖8 pH對普通變形桿菌不同種類碳源利用面積的影響Fig.8 Effect of pH values on utilization area of different carbon sources of Proteus vulgaris

圖9～圖10顯示,蜂房哈弗尼菌的碳源利用面積變化受NaCl和pH的影響與普通變形桿菌相似,隨著NaCl濃度的增加,各類碳源的利用面積逐步下降,糖類、氨基酸類和羧酸類在1%濃度下分別為1045.25±0.13、335.88±0.24和398.66±0.32,5%鹽濃度下降至460.13±0.23、177.01±0.31和204.66±0.45。pH的變化同樣對蜂房哈弗尼菌影響不明顯,在pH5.0～7.0的范圍內各組碳源利用面積相差不大。

圖9 NaCl對蜂房哈弗尼菌不同種類碳源利用面積的影響Fig.9 Effect of NaCl concentration on utilization area of different carbon sources of Hafnia alvei

研究顯示,碳源種類和濃度能夠影響細菌生物被膜形成能力,當以蔗糖為碳源時,普通變形桿菌形成的生物被膜高于葡萄糖[26],以木糖為培養基時,蜂房哈弗尼菌的生物被膜形成量最大[27]。

2.4 不同NaCl濃度和pH下菌株碳源代謝主成分分析

主成分分析是能將BIOLOG產生的大量數據轉化為少數綜合指標的一種統計分析方法,用于分析不同處理下微生物碳源代謝差異,是BIOLOG數據分析的一種常用方法[28]。圖11為培養第10 d的不同NaCl濃度和不同pH對兩株菌碳源代謝的Biolog監測數據主成分分析載荷圖,以71種碳源做主成分因子分析,兩組變量KMO系數均大于0.8,Bartlett’s檢驗的p均小于0.001,數據結構合理,具有良好相關性。普通變形桿菌前兩個主成分所構成的信息量為77.92%,主成分1貢獻度為62.45%,主成分2貢獻度為15.47%;蜂房哈弗尼菌前兩個主成分所構成的信息量為80.36%,主成分1貢獻度為68.11%,主成分2貢獻度為12.25%。

由圖11可見,不同條件下兩株菌的碳源代謝在主成分二維體系中存在空間分布差異。不同pH的分布點較為集中,彼此距離相近,可見pH的變化對普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌碳源代謝影響無顯著差異。而NaCl濃度對兩株菌碳源代謝能力的影響則不同,對于普通變形桿菌,1%～3%NaCl濃度條件下分布點與pH的距離不大,而4%與5%濃度的NaCl濃度距離較遠,向主成分1負軸和主成分2正軸偏移,說明高鹽濃度顯著影響了普通變形桿菌對不同類型碳源的代謝;對于蜂房哈弗尼菌,隨著NaCl濃度的增加,分布點逐漸向主成分1負軸和主成分2正軸偏移,5%NaCl濃度距離最遠,說明NaCl濃度對蜂房哈弗尼菌碳源代謝影響更顯著。

圖11 不同NaCl濃度及pH下兩株菌碳源代謝主成分分析載荷圖Fig.11 Principal component analysis(PCA) for Proteus vulgaris and Hafnia alvei under different concentration of NaCl and pH注:a:普通變形桿菌,b:蜂房哈弗尼菌;A1:1% NaCl, A2:2% NaCl,A3:3% NaCl,A4:4% NaCl,A5:5% NaCl; B1:pH5.0,B2:pH5.5,B3:pH6.0,B4:pH6.5,B5:pH7.0。

3 結論

通過BIOLOG技術對不同NaCl濃度和pH條件下普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌的碳源代謝能力進行研究,結果表明,兩株菌能夠利用的碳源相似,與pH相比,NaCl濃度對兩株菌的碳源代謝影響更大。在1%～5% NaCl條件下,隨著濃度升高,兩株菌的生長逐漸受到抑制,其碳源利用種類和利用面積逐漸下降,其中糖類物質受影響最大,在5% NaCl濃度下兩株菌的生長較慢,受到較大抑制。在pH5.0～7.0的范圍內,兩株菌受影響不大,隨著pH降至5.0,菌株生長受到一定抑制,但仍能維持生長。主成分分析結果與上述結果相對應,pH對兩株菌碳源代謝影響不顯著,隨著NaCl濃度的增高,分布點逐步發生偏移,差異顯著。通過比較NaCl與pH對普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌碳源代謝的影響,可為優化產品配方及深入探究其代謝機理等提供支撐。