Geobacillus thermodenitrificans α-半乳糖苷酶原核表達及其酶學性質

石征宇,魯晶娣,韋盤秋,伍時華,程謙偉,黎 婭,易 弋,*

(1.廣西科技大學生物與化學工程學院,廣西柳州 545006; 2.廣西糖資源綠色加工重點實驗室(廣西科技大學),廣西柳州 545006; 3.廣西高校糖資源加工重點實驗室(廣西科技大學),廣西柳州 545006)

α-半乳糖苷酶(α-galactosidase)又稱蜜二糖酶,屬于外切糖苷酶類,能夠專一催化糖鏈末端含α-1.6半乳糖苷鍵的多糖、糖蛋白、糖脂等物質[1],既能催化毛蕊花糖、棉籽糖、水蘇糖和蜜二糖等低聚糖,又能催化一些含α-半乳糖苷鍵的雜多糖。α-半乳糖苷酶在自然界中分布廣泛,主要存在于人、動植物及微生物體內,其中以植物來源研究較多,如水稻[2]、黃瓜[3]、咖啡豆[4]等;微生物來源主要有嗜熱脂肪芽孢桿菌[5]、長雙歧桿菌[6]、臭曲霉[7]等;此外,在各種哺乳動物體內,其組織勻漿中也含有α-半乳糖苷酶,尤其在人和鼠的甲狀腺和腎臟等部位,α-半乳糖苷酶活性最高[8]。α-半乳糖苷酶具有多種用途,主要應用于飼料加工、食品、醫學等領域。某些α-半乳糖苷酶在底物濃度較高時,具有轉半乳糖基作用,利用這一特點可將其用于低聚糖的合成及環糊精衍生物的制備[9]。

豆科植物富含蛋白質,是很好的蛋白質飼料來源,但豆科植物中存在α-半乳糖苷等抗營養因子,且這類物質用普通方法很難將其降解,當其在動物體內大量積累時,會影響機體的代謝能力,降低對營養物質的吸收[10],嚴重時會引起脹氣、厭食、腹瀉等不良癥狀[11]。利用α-半乳糖苷酶的水解特點,在飼料加工過程中添加α-半乳糖苷酶,能夠有效地降低α-半乳糖苷類抗營養因子的存在,從而促進動物的生長[12]。

在飼料加工過程中,常涉及到高溫環節,這會對酶造成不可逆的失活,因此提高α-半乳糖苷酶的熱穩定性是該酶在飼料工業大規模應用中必須解決的問題。目前,嗜熱微生物依舊是熱穩定性酶最直接和最可靠的來源[13]。Geobacillusthermodenitrificans是一種嗜熱的革蘭氏染色陽性細菌,好氧或兼性厭氧,屬于Geobacillus屬[16]。目前,國內外學者對該菌的研究甚少。本實驗利用基因工程技術,人工設計Geobacillusthermodenitrificans(NG80-2)的α-半乳糖苷酶編碼基因,并在大腸桿菌中進行重組表達,然后對該酶的酶學性質進行了系統的研究,旨在獲得具有良好熱穩定性的α-半乳糖苷酶,并為該酶的工業化應用提供相關理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌BL21(DE3)、載體pGEX-4T-3 為本實驗室保存;T4 DNA Ligase、DNA marker DL 5000 TAKARA公司;限制性內切酶EcoR I和BamH I Thermo Fisher;甘氨酸(Glycine)、氨芐青霉素、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 北京索萊寶科技有限公司;對硝基苯酚(4-nitrophenol) 天津市大茂化學試劑廠;對硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(PNPG) 上海源葉科技有限公司;對硝基苯酚(pNP) 天津市大茂化學試劑廠;Yeast Extract OXOID公司;GST瓊脂糖凝膠FF 北京韋氏博慧色譜科技有限公司;McIlvaine緩沖液:Na2HPO414.626 g、C4H2O7·H2O 10.19 g,定容至1 L;PBS緩沖液:NaCl 8.006 g,KCl 0.201 g,KH2PO40.24 g,Na2HPO4·12H2O 3.581 g,ddH2O定容至1 L,調節pH至7.4;洗脫 buffer 1:Tris 0.61 g,NaCl 0.9 g,ddH2O定容至100 mL,調節pH至8.3;洗脫buffer 2:Tris 0.61 g,還原性谷胱甘肽0.614 g,ddH2O定容至100 mL,調節pH至8.3。

SQP電子天平 賽多利斯科學儀器;UV-8000S紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;H2100R醫用離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;Tpersonal PCR儀 Biometra;S220多參數測試儀 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;BL0N-1000Y超聲波信號發生器 上海比郎儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌的構建Geobacillusthermodenitrificansα-半乳糖苷酶編碼基因的獲取:根據GenBank數據庫所提供的氨基酸序列(登錄號:WP_011887668),人工設計酶的編碼基因,并利用網絡服務器進行密碼子優化(http://www.jcat.de/Start.jsp),同時,在基因兩端分別加入EcoR I和BamH I酶切位點,送由杭州弘賽生物科技有限公司進行合成。對載體進行雙酶切,分別回收目的基因片段和表達載體片段,并利用T4連接酶于16 ℃連接12 h,將重組質粒轉化到感受態細胞E.coliBL21(DE3)中,后均勻涂布在LB固體培養基(含100 μg/mL Amp)上,37 ℃培養14 h后,挑取陽性菌落進行雙酶切和PCR驗證,并送廣州英俊有限公司進行測序。

1.2.2 重組蛋白的誘導表達 重組菌接種于LB液體培養基(含100 μg/mL Amp)中,37 ℃培養12 h后,以1%的接種量轉接到100 mL LB液體培養基(含100 μg/mL Amp),于37 ℃培養,待OD600值達到0.4～0.6時,加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)使其工作濃度為0.1 mmol/L,并在28 ℃下誘導表達5 h。將誘導完成的菌液在10000 r/min下離心10 min,去上清,用pH7.4的PBS緩沖液洗滌菌體3次,再按1∶10的體積比將菌體重懸于PBS緩沖液中,利用超聲細胞破碎儀在冰水浴下進行細胞破碎(200 W,工作8 s間歇8 s,共80次),破碎后的細胞液12000 r/min離心15 min,取上清液即為粗酶液,備用。

1.2.3 目的蛋白的純化 利用GST瓊脂糖凝膠柱對目的蛋白進行純化,純化步驟如下:用洗脫 buffer 1平衡5個柱體積,將10 mL粗酶液用洗脫 buffer 1緩沖液稀釋到20 mL,0.45 μL濾膜過濾,上樣,再用洗脫 buffer 1洗10個柱體積,用洗脫 buffer 2進行洗脫,收集洗脫液(即純酶),利用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測純化結果。

1.2.4 酶活力的測定 在pNPG法[13]的基礎上略有改動。將pNPG溶于McIlvaine緩沖液[14]中,使其終濃度為10 mmol/L。將5 μL純酶加入695 μL McIlvaine緩沖液中,37 ℃溫水浴5 min,加入50 μL 10 mol/L的pNPG,于相應的條件下反應10 min,反應完成后,加入3.25 mL 0.5 mol/L的Na2CO3溶液終止反應,于紫外可見分光光度計595 nm波長下測其OD值。按照pNG的標準曲線回歸方程y=213.27187x+0.17168(R2=0.9998),計算α-半乳糖苷酶酶活。酶活定義:1 min內水解1 μmol pNPG轉化為pNG所需的酶量,單位μmol/min。

1.2.5 酶學性質的測定

1.2.5.1 最適溫度及溫度穩定性 分別在25～75 ℃下進行酶促反應,按照1.2.4的實驗方法測定酶活,確定α-半乳糖苷酶的最適溫度;然后在45、50、55、60、65、70、75 ℃溫度下,對該酶處理不同時間(20、40、60、80、100、120、150 min),并在最適溫度下進行酶促反應,按照1.2.4的實驗方法測定酶活。以測定的最高酶活為100%,其他酶活占最高酶活的百分數即為相對酶活。

1.2.5.2 最適pH及pH穩定性 配制pH3.0～8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和pH9.0～10.0的Tirs-HCl緩沖液,將pNPG溶于不同的pH緩沖液中,在最適溫度下,按照1.2.4的實驗方法測定酶活,以確定重組酶的最適pH;將酶液在不同pH的緩沖液中,70 ℃處理1、2 h,然后pH6.0及70 ℃下進行酶促反應,以未處理的酶液作為對照,其他酶活占最高酶活的百分數即為相對酶活。

1.2.5.3 不同金屬離子對酶活性的影響 選取化合物或金屬離子Fe3+、Cu2+、K+、Ca2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Na+、Co2+、EDTA、Ag+、Ni+、Al3+、Hg+,以McIlvaine緩沖液配制工作濃度為0.5 mol/L的離子溶液,按1.2.4中的方法配制酶反應體系,在最適溫度和最適pH下進行反應。以不添加金屬離子的酶活作為100%,其他酶活占最高酶活的百分數即為相對酶活。

1.2.5.4 動力學常數的測定 利用McIlvaine緩沖液配制不同濃度的pNPG溶液(1、2、4、6、8、10 mmol/L),在最適條件下按1.2.4中的方法進行反應,以測定在不同底物濃度[S]下的反應速率V。采用雙倒數作圖法確定Km和Vmax。

1.3 數據處理

每組實驗重復三次，結果取平均值±標準差，利用Excel進行數據處理和繪圖。

2 結果與分析

2.1 α-半乳糖苷酶的純化結果

蛋白誘導表達及純化的電泳結果見圖1。泳道1是前期構建的工程菌且未添加IPTG的電泳圖,從圖1中可知,在未添加IPTG時,重組工程菌并不產生重組蛋白,而加入適量的IPTG后,α-半乳糖苷酶可在大腸桿菌宿主菌中成功表達,且重組蛋白分子量大小在100～110 kDa之間,與理論值一致(GST標簽約是26 kDa,目的蛋白約是84 kDa)。泳道5在目標位置出現單一條帶,說明目標蛋白純化效果較好。

圖1 重組蛋白純化結果Fig.1 Results of purified recombinant protein 注:M:蛋白marker;1:對照;2:誘導全蛋白質; 3:誘導上清;4:誘導沉淀;5:純化結果。

2.2 酶學性質的測定結果

2.2.1 最適反應溫度 圖2為溫度對α-半乳糖苷酶酶活的影響。由圖2可知,在相同的反應體系下,溫度為30～70 ℃時,α-半乳糖苷酶的酶活力隨溫度的升高而升高;在反應溫度為70 ℃時,α-半乳糖苷酶酶活力達到最大,可見70 ℃為α-半乳糖苷酶的最適反應溫度;而后隨著溫度繼續升高,α-半乳糖苷酶酶活力迅速下降,說明在高溫情況下該酶迅速失活,不宜在高于70 ℃的條件下進行催化反應。

圖2 溫度對α-半乳糖苷酶酶活的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity of α-galactosidase

2.2.2 溫度穩定性 按照上面1.2.4的反應體系,在不同的溫度下對純酶進行處理,最適溫度下測定剩余酶活。圖3為α-半乳糖苷酶的溫度穩定性測定結果。從圖3可以看出,α-半乳糖苷酶在45～65 ℃處理150 min后,剩余酶活還保留在55%以上,說明該酶的較適應催化溫度為45～65 ℃。而在70 ℃下處理80 min后,剩余酶活仍有60%以上,75 ℃處理60 min剩余酶活只有18%左右,因此該酶不宜在75 ℃及以上的高溫下長時間發揮作用。

圖3 α-半乳糖苷酶的溫度穩定性Fig.3 Temperature stability of α-galactosidase

2.2.3 最適pH 圖4為pH對α-半乳糖苷酶酶活的影響。由圖4可知,α-半乳糖苷酶的酶活力隨環境pH的改變出現較大的變化。當pH為2～4時,α-半乳糖苷酶的酶活力幾乎為零;而后隨著pH的升高,酶活逐漸上升,在pH6.0時酶活力達到最大;當酶反應環境的pH繼續升高時,α-半乳糖苷酶的酶活力逐漸下降。因此,重組α-半乳糖苷酶的最適pH為6.0。

圖4 pH對α-半乳糖苷酶酶活的影響Fig.4 Effect of pH on the activity of α-galactosidase

2.2.4 pH穩定性 圖5為α-半乳糖苷酶的pH穩定性測定結果。由圖5可知,在不同pH條件下對α-半乳糖苷酶處理1、2 h,其酶活保留率仍在70%以上,在pH5.0～6.5緩沖液中處理2 h,剩余酶活仍能達到原酶活的90%以上,在pH3.0～4.0的范圍內處理2 h,仍具有80%以上的活力,并且處理1、2 h,α-半乳糖苷酶的剩余酶活無明顯變化。由圖5還可看出,α-半乳糖苷酶的pH穩定性的變化趨勢與最適pH的變化趨勢極為相似,酶活性均出現先升高后降低的趨勢,并且該酶在低pH條件下穩定性較好,說明該酶適合偏酸性的環境。

圖5 α-半乳糖苷酶的pH穩定性Fig.5 pH stability of α-galactosidase

2.2.5 金屬離子及化合物對α-半乳糖苷酶的影響 金屬離子對α-半乳糖苷酶酶活的影響結果見圖6。從圖6可知,Cu2+、Ag+、Hg+能夠完全抑制α-半乳糖苷酶的活性,而Fe3+、Ca2+、Mn2+、Zn2+對α-半乳糖苷酶的活性具有不同程度的激活作用,其中以Zn2+對α-半乳糖苷酶的激活效果最好,EDTA、K+、Na+、Al3+、Ni+等離子對α-半乳糖苷酶酶活性影響不大。

圖6 金屬離子及化學試劑對α-半乳糖苷酶酶活的影響Fig.6 Effects of metal ions and chemical reagents on the activity of α-galactosidase

2.2.6α-半乳糖苷酶動力學常數的測定結果 按照米氏方程,采用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法測定α-半乳糖苷酶的Km和Vmax,結果如圖7所示。在最佳反應條件下,α-半乳糖苷酶的Km為10.04 mmol/L,Vmax為18.25 μmol/min。

圖7 α-半乳糖苷酶的Lineweaver-Burk曲線Fig.7 Lineweaver-Burk curve of α-galactosidase

3 討論

Geobacillusthermodenitrificans屬于Geobacillus屬[15],Geobacillus屬的菌株多分布在火山、油田、干草堆等高溫環境,具有嗜熱、降解烴等應用價值,由于所處環境特殊,這類細菌可能具有某些特種酶或特殊功能的基因。本研究利用大腸桿菌原核表達系統對來源于Geobacillusthermodenitrificans的α-半乳糖苷酶編碼基因進行了重組表達,利用GST瓊脂糖凝膠柱對目的蛋白進行純化,經SDS-PAGE檢測顯示,重組α-半乳糖苷酶分子量為100～110 kDa。酶學性質結果顯示,重組α-半乳糖苷酶的最適反應溫度為70 ℃,與其它研究所報道的α-半乳糖苷酶的最適溫度相比較高,李蘇紅等[2]研究重組水稻α-半乳糖苷酶的最適反應溫度為45 ℃;陳俊亮等[6]研究長雙歧桿菌α-半乳糖苷酶,結果顯示該酶的最適反應溫度為42 ℃。本研究得到重組α-半乳糖苷酶的最適pH為6.0,這與大多數的研究結果相近[14],并且重組酶在pH3.0～4.0的范圍內處理2 h,仍具有80%以上的活力,說明該酶可在偏酸性條件下長時間發揮催化作用。

不同金屬離子對酶分子活性呈現出不同的特性,有的可以使酶的活性降低甚至喪失,有的卻可以使酶活力提高或者增加酶的穩定性。在本研究中,Hg+能夠強烈抑制α-半乳糖苷酶的活性,這與陳俊亮等人報道的Hg+是α-半乳糖苷酶的抑制劑相符[6]。Hg+之所以能夠抑制α-半乳糖苷酶的活性,可能是因為在該酶的催化位點附近含有半胱氨酸殘基,Hg+通過與半胱氨酸殘基殘基側鏈上的巰基發生作用,從而抑制α-半乳糖苷酶的活性[16]。有研究報道指出,Ag+對α-半乳糖苷酶表現出了強烈的抑制作用[17],這與本研究結果一致,Ag+對α-半乳糖苷酶的抑制作用,可能是因為在該酶的活性中心位置,存在組氨酸或含有羧基的氨基酸[18]。Mn2+、Zn2+、Fe3+等離子對酶活有激活作用,以Zn2+離子最為顯著,其原因可能是,通過電荷間的相互作用增加了鹽橋的數量,鹽橋間相互交聯產生了穩定的三級結構[19]。K+和Na+離子對α-半乳糖苷酶活性無明顯影響,可能是因為K+、Na+等離子是胞內外常見離子,其生物學作用主要是維持細胞內外的滲透壓以及中和陰離子的電荷。EDTA作為一種常見的金屬離子絡合劑,通過與酶活中心的金屬離子形成穩定的絡合物,進而影響酶的催化效率,但在本研究中發現EDTA對酶活性的影響很小,這與李蘇紅[2]、密士軍[16]等人的研究結果相一致,這可能是因為該酶的活性中心并不存在金屬離子輔基,進而不能與EDTA形成絡合物。

通過Lineweaver-Burk雙倒數作圖法得到,α-半乳糖苷酶的Km為10.04 mmol/L,Vmax為18.25 μmol/min,這與沈汪洋等[4]測定的咖啡豆α-半乳糖苷酶的Km=0.556 mmol/L、Vmax=1.19 μmol/min有較大的差別[4],通過對比Km值發現,咖啡豆α-半乳糖苷酶對底物的親和能力強于本研究α-半乳糖苷酶,但最大反應速率低于本研究。

4 結論

對重組工程菌進行IPTG誘導,并對破包后的粗酶液進行GST瓊脂糖凝膠柱純化,經SDS-PAGE后測得重組蛋白的分子量為100～110 kDa。酶學性質結果表明,重組α-半乳糖苷酶的最適反應溫度為70 ℃,最適pH為6.0,并且重組酶在pH3.0～4.0的范圍內處理2 h,仍具有80%以上的活力,說明該酶可在偏酸性條件下長時間發揮催化作用,Cu2+、Ag+、Hg+能夠完全抑制α-半乳糖苷酶的活性,而Fe3+、Ca2+、Mn2+、Zn2+對α-半乳糖苷酶的活性具有不同程度的激活作用,其中以Zn2+對α-半乳糖苷酶的激活效果最好,在最佳反應條件下測得α-半乳糖苷酶的Km為10.04 mmol/L,Vmax為18.25 μmol/min。目前,耐熱α-半乳糖苷酶的工業化生產尚未實現,因此發掘性質優良的α-半乳糖苷酶迫在眉睫。與其它已報道的α-半乳糖苷酶相比,本研究的重組α-半乳糖苷酶具有較好的熱穩定性和pH穩定性等優點,較其他來源的α-半乳糖苷酶有更好的應用前景。