赤魚魚皮制備膠原肽的酶解工藝優(yōu)化及其理化特性分析

李劍瑛,施沈佳,黎中寶,陳俊德,劉 睿

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,福建廈門 361021; 2.國(guó)家海洋局海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心, 國(guó)家海洋局第三海洋研究所，福建廈門 361005; 3.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇南京 210023)

赤魟魚是我國(guó)常見的經(jīng)濟(jì)魚類,其尾刺、肝、軟骨均具有藥用價(jià)值。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)于赤魟的研究主要集中在尾刺、線粒體等[1-2]。然而,關(guān)于赤魟魚魚皮膠原肽的研究未見報(bào)道。赤魟魚魚皮富含膠原,是提取膠原及其衍生物良好的原料[3]。近年來,傳染性疾病如禽流感、牛海綿狀腦病和口蹄疫等的爆發(fā)和伊斯蘭、回教教徒信仰方面的忌諱,引發(fā)人們對(duì)豬、牛等陸源生物膠原使用的擔(dān)憂[4]。水產(chǎn)品魚類在加工生產(chǎn)過程中,會(huì)產(chǎn)生巨量的加工副產(chǎn)物魚皮,造成環(huán)境污染,若能將其合理開發(fā)利用,可實(shí)現(xiàn)低值資源高值化利用。

膠原肽廣泛應(yīng)用于藥品、食品、保健品和化妝品等領(lǐng)域。世界膠原市場(chǎng)需求量高達(dá)20萬噸,銷售額210億美元,并呈增長(zhǎng)趨勢(shì),具有巨大的市場(chǎng)前景[5]。酶解法具安全、可控、環(huán)保等特點(diǎn),是開發(fā)高附加值膠原肽的主流方法[6]。因此,本研究以赤魟魚魚皮為原料制備明膠,在此基礎(chǔ)上,以水解度為指標(biāo),確定蛋白酶酶解魚皮明膠的最佳工藝條件,鑒定酶解膠原肽的氨基酸序列,并測(cè)定其理化性質(zhì),為膠原肽的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤魟魚(Dasyatisakaje)魚皮 福建省漳州市東山縣;動(dòng)物蛋白酶(20000 U/g) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;堿性蛋白酶(200000 U/g)、胰蛋白酶(4000 U/g)、中性蛋白酶(200000 U/g)、菠蘿蛋白酶(500000 U/g)、木瓜蛋白酶(800000 U/g) 食品級(jí),南寧龐博生物工程有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 北京碧云天生物公司;茚三酮 分析純,北京百靈威科技有限公司;玉米油 益海嘉里食品營(yíng)銷有限公司。

DSHZ300A恒溫水浴搖床 太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;UV-1780紫外分光光度計(jì) 島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司;便攜式pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;戴安 U3000Nano RSLC 納升液相系統(tǒng) 美國(guó)DIONEX公司;Thermo LTQ Orbitrap XL質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 赤魟魚皮明膠的提取 參考Kala等[7]方法并稍作修改,去除脂肪、肌肉后的魚皮依次用0.2 g/L NaOH、0.2 g/L硫酸溶液、0.2 g/L檸檬酸溶液浸泡45 min后,水洗至中性濾干水分備用。250 g魚皮(濕重)加入2.5 L蒸餾水,水浴45 ℃下攪拌10 h提取明膠。明膠提取液室溫下4500 r/min離心30 min后,將上清液置于冷凍干燥凍機(jī)中凍干,凍干后樣品放于-40 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酶的篩選 分別選用菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、動(dòng)物蛋白酶,確定酶加量2 g/L,底物濃度5 g/L,水解時(shí)間6 h,按表1所示,在各蛋白酶最適pH和溫度條件下進(jìn)行水解,酶解后于100 ℃水浴滅酶15 min,冰浴冷卻,冷凍干燥并檢測(cè)其水解度。選擇水解度最高的酶用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。各酶的酶解條件如表1。

表1 六種酶對(duì)赤魟魚皮明膠的酶解作用Table 1 Enzymolysis effect of six enzymes on gelatin of Dasyatis akajei skin

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 利用1.2.2節(jié)篩選出的水解度最高的酶酶解赤魟魚魚皮明膠,固定溫度40 ℃、時(shí)間6 h、酶加量2 g/L、底物濃度5 g/L,考察不同pH(3.5、4.5、5.5、6.5、7.5)對(duì)水解度的影響;固定時(shí)間6 h、酶加量2 g/L、底物濃度5 g/L、pH5.5,考察不同溫度(30、35、40、50、60 ℃)對(duì)水解度的影響,固定溫度40 ℃、pH5.5、酶加量2 g/L、底物濃度5 g/L,考察時(shí)間(1、2、3、4、5、6 h)對(duì)水解度的影響,固定溫度40 ℃、pH5.5、底物濃度5 g/L、時(shí)間3 h,考察加酶量(0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 g/L)對(duì)水解度的影響,固定溫度40 ℃、pH5.5、底物濃度5 g/L、時(shí)間3 h、酶加量5 g/L,考察底物濃度(1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 g/L)對(duì)水解度的影響。通過單因素實(shí)驗(yàn),考察各單因素變量對(duì)赤魟明膠水解度的影響。

1.2.4 赤魟魚皮明膠酶解條件響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Benhnken組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以水解度為指標(biāo),考察pH、溫度、時(shí)間、加酶量對(duì)水解度的影響,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。經(jīng)過酶解得到的物質(zhì)為膠原肽。將最優(yōu)條件下獲取的膠原肽用于1.2.5理化性質(zhì)的檢測(cè)。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 2 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 赤魟魚魚皮膠原肽理化性質(zhì)檢測(cè)

1.2.5.1 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)表征膠原肽 將10 mg膠原肽溶于0.1 g/L的三氟乙酸溶液中,SepPak C18柱脫鹽,離心冷凍干燥后,將樣品重新溶解于乙腈/甲酸/水(2∶0.2∶98,v/v)中。色譜條件:色譜柱:5 μm Reprosil C18 AQ柱(75 μm×150 mm),進(jìn)樣量5 μL;流速:400 nL/min;流動(dòng)相A:乙腈/甲酸/水(2∶0.2∶98,v/v);流動(dòng)相B:乙腈/甲酸/水(80∶0.2∶20,v/v);2%～30% B線性梯度洗脫150 min。質(zhì)譜條件:噴霧電壓2.5 kV;離子傳輸毛細(xì)管溫度200 ℃;碰撞氣體:He,碰撞能量:35%,激活時(shí)間:30 ms;質(zhì)譜一級(jí)全掃描范圍:m/z 300～2000;串聯(lián)質(zhì)譜分析采用一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)依賴二級(jí)質(zhì)譜掃描模式。Xcalibur 2.0.7和Tune 2.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[8]。

1.2.5.2 膠原肽水解度的測(cè)定 配制質(zhì)量濃度為0.65 g/L的膠原肽,取2 mL加入1 mL茚三酮顯色液,于100 ℃沸水中加熱15 min,取出冰浴冷卻后,加5 mL體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液充分混勻后,靜止15 min,于570 nm處檢測(cè)其吸光度。用6 mol/L HCl配制0.65 g/L的明膠溶液于120 ℃下水解24 h完全水解明膠,并檢測(cè)其水解度(degreeof hydrolysis,DH)[9]。用甘氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0397x-0.0105,相關(guān)系數(shù)r=0.9992,線性范圍在0～20 ug/mL。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求出氨基態(tài)氮的含量,計(jì)算公式如下。

水解度(%)=(水解液中氨基態(tài)氮含量-原料中氨基態(tài)氮含量)/原料中總氮含量×100

1.2.5.3 膠原肽溶解度的測(cè)定 配置質(zhì)量濃度為1 g/L的膠原肽,用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH2～8后。溶液在25 ℃攪拌30 min,8000×g離心10 min[10]。利用微量BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒,測(cè)定蛋白質(zhì)含量,計(jì)算公式如下所示。

1.2.5.4 膠原肽脂肪吸收能力(FAC)的測(cè)定 取500 mg膠原肽與10 mL玉米油混合。25 ℃下靜置30 min,每隔10 min均質(zhì)一次,2000×g離心25 min。測(cè)量上清液體積[11]。

式中:V1:實(shí)驗(yàn)加油量(mL);V2:離心后剩余的油的量(mL);m:樣品質(zhì)量(g)。

1.2.5.5 膠原肽持水能力(WHC)的測(cè)定 500 mg膠原肽溶于50 mL去離子水中,均質(zhì)120 s后,在25 ℃下保持30 min,5000×g離心30 min。去上清液,離心管與沉淀物一起稱重[12]。

式中:m1:離心后樣品與離心瓶的質(zhì)量(g);m2:離心瓶的質(zhì)量(g);m3:樣品的質(zhì)量(g)。

1.2.5.6 膠原肽起泡性能(FC)和泡沫穩(wěn)定性(FS)的測(cè)定 配制質(zhì)量濃度為0.5 g/L濃度的膠原肽,取20 mL膠原肽溶液用1 mol/L HCl及1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至 2、4、6、8和10,1600 r/min 25 ℃下均質(zhì)120 s后,將樣品快速轉(zhuǎn)移至250 mL量杯容器中,并在30 s后記錄總體積[13]。將FS定為3 min后剩余的泡沫體積的百分比。

式中:V1:攪打后靜止30 s體積(mL);V2:攪打前體積(mL)。

式中:V3:靜置3 min后的體積(mL);V2:攪打之前的體積(mL)。

1.2.5.7 膠原肽乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定 用0.5 mol/L的乙酸溶液配制0.5 g/L的膠原肽溶液,用2 mol/L的HCl溶液及2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至2、3、4、5、6、7和8,并定容至10 mL,再加入10 mL的玉米油,10000 r/min均質(zhì)2 min。移入50 mL離心管中,1500 r/min離心5 min[14]。

式中:V1:離心后乳化混合膠原肽液體積(mL);V2:均質(zhì)乳化后混合膠原肽溶液總體積(mL)。

將樣品與玉米油混合液1000 r/min 均質(zhì)2 min,在15、30、45、60和75 min測(cè)量離心管中上層乳化層的高度。

式中:V2:剩余乳化液體積(mL);V3:原乳化液體積(mL)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 赤魟魚魚皮提取明膠得率

赤魟明膠得率達(dá)56.52%±0.03%,該結(jié)果比軍曹魚13.8%[7]、舌鰨10.3%[7]、亞洲鱸魚27.3%高[15],比海鱸66.4%低[16]。明膠產(chǎn)量高低與魚的物種及提取條件有關(guān)。魚的物種不同，其魚皮組成和基質(zhì)不同[17],預(yù)處理時(shí)酸和堿處理使魚皮充分膨脹,膨脹時(shí)交聯(lián)被打開,使得產(chǎn)率提高[7]。本研究中赤魟魚皮的明膠得率較高,可用于商業(yè)明膠的提取。

2.2 酶的篩選

由圖1所示,水解度最高為菠蘿蛋白酶16.38%±0.50%,其次分別是堿性蛋白酶、動(dòng)物蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶,最低的為木瓜蛋白酶10.74%±0.19%。酶的特異性使其與底物作用的位點(diǎn)存在差異性,酶解得到膠原肽的數(shù)量和明膠被水解的程度不同[18]。為了進(jìn)一步了解酶解條件對(duì)明膠水解度的影響,我們選取菠蘿蛋白酶制備赤魟魚魚皮膠原肽。

圖1 魚皮明膠酶解液水解度Fig.1 Hydrolysis degree of gelatin hydrolysate from skin of Dasyatis akajei注:圖上方字母不同表示差異顯著(p<0.05),圖2～圖6、圖8～圖12同；BL表示菠蘿蛋白酶酶解液,JX表示堿性蛋白酶酶解液,DW表示動(dòng)物蛋白酶酶解液,ZX表示中性蛋白酶酶解液,Y表示胰蛋白酶酶解液,MG表示木瓜蛋白酶酶解液。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)分析

2.3.1 pH對(duì)膠原肽水解度的影響 如圖2所示,明膠的水解度隨著pH升高,呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),pH在3.5～5.5范圍內(nèi),水解度隨著pH的增大而增大,當(dāng)pH為5.5時(shí)水解度達(dá)到最大值15.55%±0.10%,后隨著pH的升高而下降。主要是因?yàn)閜H通過影響酶的活性和底物的構(gòu)象進(jìn)一步影響明膠的水解度[19]。故本研究選取pH5.5為最適pH。

圖2 pH對(duì)酶解產(chǎn)物水解度的影響Fig.2 Effects of pH on the hydrolysis degree of enzymatic hydrolysates

2.3.2 溫度對(duì)膠原肽水解度的影響 如圖3所示,明膠的水解度隨著溫度升高,呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在30～40 ℃范圍內(nèi),水解度隨著溫度的升高而增大,當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)達(dá)到最大值17.47%±0.68%,后隨著溫度升高而下降。可能是因?yàn)殡S著溫度的上升,酶的活性逐漸升高,酶解效率逐漸增高,當(dāng)達(dá)到一定程度后,隨著溫度的升高蛋白酶變性導(dǎo)致酶活下降,酶解效率從而逐漸下降[20],因此水解度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。故本研究選取40 ℃為最適酶解溫度。

圖3 溫度對(duì)酶解產(chǎn)物水解度的影響Fig.3 Effect of temperature on the hydrolysis degree of enzymatic hydrolysates

2.3.3 酶解時(shí)間對(duì)膠原肽水解度的影響 如圖4所示,明膠蛋白的水解度隨酶解時(shí)間的增加,呈現(xiàn)先上升后穩(wěn)定的趨勢(shì)。酶解時(shí)間為1～3 h時(shí),水解度隨著時(shí)間的增加而增大,在3 h時(shí)達(dá)到最大值14.45%±0.18%,3 h后無顯著變化。這可能與酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)有關(guān),反應(yīng)前期由于酶和底物濃度均較高,因此反應(yīng)朝著正反應(yīng)方向進(jìn)行,隨著時(shí)間的推移,底物濃度不斷發(fā)生反應(yīng),含量不斷減少,反應(yīng)變得緩慢,后期基本保持不變[21]。因此隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),水解度呈現(xiàn)先上升后穩(wěn)定的趨勢(shì)。故本研究選取3 h為最適酶解時(shí)間。

圖4 時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物水解度的影響Fig.4 Effects of time on the hydrolysis degree of enzymatic hydrolysates

2.3.4 加酶量對(duì)膠原肽水解度的影響 如圖5所示,加酶量在0.1～5 g/L范圍內(nèi),水解度隨著加酶量的增大而增大,5 g/L時(shí)達(dá)到最大值15.56%±0.37%。可能是因?yàn)榧用噶繉?duì)水解度的影響主要與酶和底物的結(jié)合位點(diǎn)及形成的中間產(chǎn)物的量有關(guān),反應(yīng)前期由于底物濃度較高,此時(shí)底物與酶結(jié)合位點(diǎn)還有空余,且反應(yīng)生成的中間產(chǎn)物較少,因此隨著加酶量的增大水解度呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)[22-23]。當(dāng)加酶量大于5 g/L后水解度無顯著變化(p>0.05)。可能是因?yàn)殡S著酶加量進(jìn)一步增大,底物與酶的結(jié)合位點(diǎn)不斷減少,中間產(chǎn)物逐漸增多達(dá)到飽和狀態(tài),因此隨著加酶量的升高,水解度上升緩慢甚至出現(xiàn)輕微下降的趨勢(shì)。故本實(shí)驗(yàn)選取加酶量為5 g/L為最適加酶量。

圖5 加酶量對(duì)酶解產(chǎn)物水解度的影響Fig.5 Effects of enzyme addition on degree of hydrolysis of enzymatic hydrolysates

2.3.5 底物濃度對(duì)膠原肽水解度的影響 如圖6所示,明膠蛋白的水解度隨著底物濃度增加,呈現(xiàn)先上升后穩(wěn)定的趨勢(shì)。在1～7.5 g/L范圍內(nèi),水解度隨著底物濃度的增大而增大,7.5 g/L時(shí)達(dá)到最大值15.85%±0.5%,大于7.5 g/L呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。考慮成本問題本研究選取底物濃度為5 g/L。

圖6 底物濃度對(duì)酶解產(chǎn)物水解度的影響Fig.6 Effects of substrate concentration on the degree of hydrolysis of enzymatic hydrolysates

2.4 酶解實(shí)驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在單因素的基礎(chǔ)上,固定底物濃度為5 g/L,以pH、溫度、時(shí)間、加酶量這4個(gè)因素為自變量,水解度為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),其方案及結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The design and results of response surface experiment

2.4.2 模型的建立及方差分析 對(duì)其進(jìn)行多元回歸擬合,得取代度的二次多項(xiàng)式回歸方程為:

Y=19.65-2.34A+1.97B+2.53C+2.7D-2AB-0.8AC+1.56AD-0.69BC-BD+0.96CD-6.78A2-2.19B2-3.6C2-4.61D2

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic response model with degree of substitution

2.5 赤魟魚魚皮膠原肽理化性質(zhì)及功能特性檢測(cè)結(jié)果

2.5.1 LC-MS/MS對(duì)膠原肽表征 利用LC-MS/MS從樣品中鑒定出180個(gè)肽(表5)。如圖7所示,計(jì)算每個(gè)肽的氨基酸殘基的數(shù)量(共2174個(gè)氨基酸殘基),可知親水氨基酸的總頻率為1346/2174,疏水氨基酸的總頻率為828/2174。同時(shí),利用兩親性指數(shù)(GRAVY)來評(píng)價(jià)肽的親疏水性(<0表示親水性,>0表示疏水性),可知親水性肽占66.11%,疏水性肽占33.89%。因此膠原肽整體表現(xiàn)為親水性,這與親水肽更容易在酶解過程中被釋放出來相關(guān)。肽的分子量在707.40～2021.04 Da之間,0.56%的肽分子量大于2000 Da,99.44%的肽分子量低于2000 Da。Roberts等[25]認(rèn)為肽的分子量越低越容易越過膜屏障,進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng),達(dá)到高吸收效果。故本實(shí)驗(yàn)所制備的膠原肽可能通過腸吸收發(fā)揮作用。

圖7 膠原肽的基本信息Fig.7 Basic information of collagen peptides注:a:膠原肽的氨基酸殘基；b:膠原肽的兩親性指數(shù)；c:膠原肽的分子量分布;不同字母分別為不同氨基酸簡(jiǎn)寫：A(丙氨酸)、C(半胱氨酸)、D(天冬氨酸)、E(谷氨酸)、F(苯丙氨酸)、G(甘氨酸)、H(組氨酸)、I(異亮氨酸)、K(賴氨酸)、L(亮氨酸)、M(蛋氨酸)、N(天冬酰胺)、P(脯氨酸)、Q(谷氨酰胺)、R(精氨酸)、(絲氨酸)、T(蘇氨酸)、V(纈氨酸)、W(色氨酸)、Y(酪氨酸)，表5同。

表5 肽的鑒定與分子量信息Table 5 Peptides identification and molecular weight

續(xù)表

2.5.2 pH對(duì)膠原肽溶解性的影響 如圖9所示,不同pH條件下膠原肽溶解度均達(dá)到90%以上。研究發(fā)現(xiàn)膠原肽分子量的大小與其溶解性呈負(fù)相關(guān),這可能是因?yàn)榉肿恿吭叫∑渌鈺r(shí)產(chǎn)生更多的極性殘基,這些殘基可與水分子形成氫鍵增加其溶解性[26],且Balti等[27]研究也發(fā)現(xiàn)酶水解可溶性較低的蛋白質(zhì)復(fù)合物,將可溶性肽釋放出來進(jìn)而改善蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的溶解性。膠原肽鑒定結(jié)果表明99.44%的膠原肽分子量低于2000 Da,該結(jié)果與膠原肽表現(xiàn)出的良好的溶解性相對(duì)應(yīng),良好的溶解性使膠原肽具有成為配方食品體系重要成分的潛力。

圖8 pH對(duì)膠原肽溶解性的影響Fig.8 Effects of pH on the solubility of collagen peptides

2.5.3 pH對(duì)膠原肽起泡性及其穩(wěn)定性的測(cè)定的影響 如圖9所示,膠原肽的起泡性隨pH的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),pH為6時(shí)其起泡性最高達(dá)到15.38%±0.15%,pH為2時(shí)最低為7.69%±0.08%。膠原肽的起泡性與體積和表面粘度、膜兩側(cè)的電斥力、表面張力等因素有關(guān)[28]。由于起泡性是蛋白質(zhì)的界面性質(zhì),其對(duì)食品的質(zhì)構(gòu)及口感有影響,因此,膠原肽在pH為6時(shí),具有應(yīng)用到飲料、烘培、糖果、甜食中的潛力[29]。

圖9 pH對(duì)膠原肽起泡性的影響Fig.9 Effects of pH on the sudsing of collagen peptides

由圖10可知,膠原肽的起泡穩(wěn)定性隨著pH的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),pH為6時(shí)其穩(wěn)定性最好達(dá)到14.36%±0.14%。當(dāng)pH小于4或pH大于8,其起泡性及起泡穩(wěn)定性較低,主要與膠原肽分子的凈電荷量有關(guān),此時(shí)凈電荷較高,排斥效果顯著,導(dǎo)致其在界面上不能形成致密的、穩(wěn)定的排列順序[30]。

圖10 pH對(duì)膠原肽起泡穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effects of pH on foaming stability of collagen peptide

2.5.4 pH對(duì)膠原肽乳化性及其穩(wěn)定性的影響 如圖11所示,膠原肽的乳化性隨著pH的增大,整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),pH為3時(shí)乳化性達(dá)到最大值78.82%±0.22%,pH為8時(shí)達(dá)到最小值63.99%±0.52%。該乳化性比酪蛋白(73.4%)低,比鱈魚皮膠原蛋白肽(56.0%)高[31]。乳化性的高低與膠原肽的分子量有關(guān),分子量越小其疏水基團(tuán)暴露越多,將會(huì)打破親疏水平衡的關(guān)系,使得界面張力減弱,最終導(dǎo)致乳化性降低[31],而pH的變化將會(huì)使膠原肽表面與脂質(zhì)周圍保護(hù)層的疏水性發(fā)生改變,從而使膠原肽乳化性發(fā)生變化[32]。

圖11 pH對(duì)膠原肽乳化性的影響Fig.11 Effects of pH on emulsification of collagen peptide

圖12所示,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),膠原肽的乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì),在45 min時(shí)其乳化穩(wěn)定性趨于穩(wěn)定達(dá)到40.87%±0.37%,這可能與肽的分子量有關(guān)系,分子量越小,其越不容易在水與油界面之間擴(kuò)散和吸附形成膜,從而使乳化穩(wěn)定性降低[33]。

圖12 酶解時(shí)間對(duì)膠原肽起乳化穩(wěn)定性的影響Fig.12 Effect of time on emulsion stability of collagen peptides

2.5.5 膠原肽脂肪吸收能力 蛋白肽的脂肪吸收能力是蛋白質(zhì)的非極性疏水區(qū)與脂肪非極性脂肪族鏈的相互作用的結(jié)果,一般以每克蛋白質(zhì)吸收油的毫升數(shù)來表示。赤魟魚膠原肽的脂肪吸收能力為(8.98±0.01) mL/g蛋白,優(yōu)于石魚膠原肽6.25 mL/g蛋白[34]、大鯢魚皮膠原蛋白肽2.57 mL/g蛋白、豬皮膠原蛋白肽1.65 mL/g蛋白[35],良好的脂肪吸收能力可使食品中油脂的添加量加大,因此可以使食品可口又不油膩[36];可用于糖果或肉類加工過程中的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中,例如利用較好的脂肪吸收能力來提高香腸的脂肪和水分的含量[37]。

2.5.6 膠原肽持水能力 蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的持水能力與蛋白質(zhì)的去折疊和變性以及碳水化合物及其他非蛋白質(zhì)成分有關(guān)[38],赤魟魚皮膠原肽的持水能力(3.25±0.05) g/g肽,遠(yuǎn)高于LIF(0.21±0.03) g/g肽[39],良好的持水能力可加入碎肉中以提高蒸煮的產(chǎn)量[40]或應(yīng)用于化妝品中[39]。

3 結(jié)論

本研究確定制備赤魟魚魚皮膠原肽的蛋白酶為菠蘿蛋白酶,通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)分析,調(diào)整后的膠原肽的最佳制備條件為pH5.00、溫度44.5 ℃、時(shí)間3.7 h、加酶量6.00 g/L。在此條件下,膠原肽的水解度為20.47%±0.11%,與預(yù)測(cè)值21.18%無顯著差異。利用LC-MS/MS鑒定分析膠原肽結(jié)構(gòu),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,膠原肽酶解液含180個(gè)肽,這些肽分子量為707.40～2021.04 Da;其中99.44%的肽分子量低于2000 Da,易被人體吸收。這些肽中66.11%肽為親水性肽,33.89%肽為疏水性肽,說明膠原肽具有較好的溶解性,這與不同的pH條件下,膠原肽的溶解性都大于90%的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。進(jìn)一步理化性質(zhì)研究結(jié)果表明:pH為6時(shí)膠原肽起泡性和起泡穩(wěn)定性均達(dá)到最大值分別為15.38%±0.15%及14.36%±0.14%,pH為3時(shí)乳化性達(dá)到最大值78.82%±0.22%;持水能力為(3.25±0.05) g/g;脂肪吸收能力為(8.98±0.01) mL/g蛋白。本研究以水產(chǎn)加工副產(chǎn)物魚皮為原料,建立酶解法制備高附加值膠原肽的工藝技術(shù),鑒定膠原肽的氨基酸序列,并分析其理化特性,為低值海洋生物資源高值化利用提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。后續(xù)研究將會(huì)將膠原肽往功能食品、藥品方向開發(fā)。