一種含肉桂醛包裝紙對面包腐敗發霉的抑制作用

田 芳,李凱龍,李 勇,唐嬌艷,張周洋

(1.郴州市食品藥品檢驗檢測中心,湖南郴州 423000; 2.湖南省食品質量監督檢驗研究院,湖南長沙 410111)

面包營養豐富,水分含量高,容易發霉變質,特別是在高溫高濕環境中,兩三天內就能長霉,使其失去食用價值,造成浪費,且易引起食物中毒。因此抑制面包霉腐變質,延長面包貨架期,是一個重要的食品安全問題。匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)亦稱黑面包霉,極易侵染在密閉潮濕環境中存放的面包和水果。抑制切片面包霉變的傳統方法主要有紫外線滅菌處理、無菌包裝和添加化學防腐劑(如苯甲酸、丙酸鈣、脫氫乙酸和山梨酸)等[1]。隨著食品包裝新材料和新技術的開發應用,將具有抗菌活性的天然抗菌劑添加到食品包裝材料上是現代食品包裝的趨勢,一方面,活性包裝材料可以減少微生物污染,保障食品品質;另一方面則可有效減少食品中防腐劑的添加,滿足消費者的購買需求[2-5]。前人研究結果表明,天然香精油因其富含萜烯類和酚類化合物,具有很強的抗菌特性[6],可以作為食品防腐劑添加到食品中發揮其抗菌作用[7-8],也可以添加到食品包裝中制成抗菌活性包裝材料發揮其抗菌作用[9]。

從肉桂中提取的肉桂精油,對細菌、霉菌和酵母均有很強的抑制作用,且短暫的加熱處理對肉桂精油的抑菌效果無明顯影響[10]。而肉桂精油中肉桂醛的含量為86.8%,是其主要抗菌成分[11-12]。植物源肉桂醛作為一種天然香料,已被聯合國糧農組織與世界衛生組織(FAO/WHO)以及美國食品藥品監督管理局(FDA)認定為安全無毒的化學成分,食品添加劑聯合專家委員會(JECFA)和美國香味料和萃取物質制造者協會(FEMA)也認定其為一種安全放心的食品香料成分和食品添加劑,我國也于2011年將其納入食品添加劑國家安全標準GB28346-2012[13]。研究表明肉桂醛可能是通過損傷霉菌細胞質膜而進入細胞,改變胞內大分子空間結構導致霉菌正常的新陳代謝被破壞,從而抑制霉菌的生長[14]。王新偉等[15]的研究表明肉桂醛對面包酵母和黑曲霉均有明顯的抑制作用,且肉桂醛體外抗菌活性測定氣體擴散法抗黑曲霉效果優于牛津杯法。本研究通過將含量不同的肉桂醛石蠟涂層應用于包裝紙上,制成一種新型面包抑菌活性包裝材料,研究活性包裝材料及其內面包對黑面包霉的抑制作用,同時通過設置間接擴散實驗和測定活性包裝材料內面包中肉桂醛的含量,用以探索肉桂醛應用于面包包裝材料的可行性及其發揮抑菌作用的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

OPP透明食品自粘包裝紙(食品級) 桐城市昌宏包裝有限公司;特級小麥粉 郴州市步步高超市;植物源提取肉桂醛 上海阿拉丁生化科技有限公司;食品包裝石蠟(食品級) 鄭州松泰化工產品有限公司;黑面包霉(RhizopusstoloniferATCC30306) 中國微生物菌種保藏中心;乙酸乙酯(色譜純) 德國Meker公司;馬鞭草烯酮標準品(CAS No.:18309-32-5) 法國中草藥EXTRASYNTHESE公司;平板計數瓊脂(生化試劑) 青島海博生物技術有限公司。

Hewlett-Packard 6890N氣相色譜儀、5975B inert XL MSD質譜檢測器 美國安捷倫科技有限公司;SPX-100B-Z恒溫培養箱 上海博訊醫療生物儀器股份有限公司;DHG-9140A電熱鼓風干燥箱 上海培因實驗儀器有限公司;BCD-196TXZ型冰箱 青島海爾股份有限公司;Milli-Q凈化器 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物的培養 取保存于-20 ℃冰箱中的匍枝根霉R.stoloniferATCC30306凍干菌種,在PDA培養基中于30 ℃條件下孵化5 d得到活化霉菌,利用生理鹽水沖洗培養皿蓋子上的真菌孢子收集得到孢子懸浮液,調整孢子懸浮液濃度為102CFU/mL備用。

1.2.2 面包制作工藝 面包制作按照國家標準(GB/T 14611)小麥粉面包烘焙品質試驗直接發酵法[16],經過稱樣、和面、發酵和揉壓、成型、醒發、烘烤制得到即食面包,然后將面包切成均勻的切片面包,現做現用。

1.2.3 活性包裝紙的制作 將食品級石蠟加熱到60 ℃后添加不同質量的肉桂醛,得到肉桂醛質量分數分別為1%、2%、4%和6%(w/w)的混合石蠟涂液,然后將相同質量的石蠟均勻涂布薄薄的蠟層于OPP透明食品自粘包裝紙的一面,常溫條件下干燥后待用。涂布不添加肉桂醛石蠟的包裝紙為陰性對照,不涂布石蠟的包裝紙為空白對照。

1.2.4 包裝紙體外抑菌實驗 體外抑菌實驗:將100.0 μL 102CFU/mL的孢子懸浮液接種于土豆培養基中,每處理設置10個培養皿,隨后將空白對照包裝紙、陰性對照包裝紙和活性包裝紙剪成1 cm×1 cm的小方塊粘在培養皿蓋上,25 ℃培養箱中培養(時間以空白對照培養基中長出霉菌為準),評估肉桂醛不同含量活性包裝紙的抑菌效果,所有處理重復10次,抑菌率以長出霉菌培養皿數占總培養皿的比例計算而得。

1.2.5 切片面包防霉實驗 通過前期預實驗發現1.0×105CFU/mL是誘導面包霉變的最佳孢子溶度,因此將孢子濃度為1.0×105CFU/mL或1.0×106CFU/mL的200 μL孢子懸浮液涂抹在一片切片面包上,然后將感染黑面包霉的切片面包放置于兩片沒有感染黑面包霉的面包中間,然后分別用空白對照、陰性對照和1%～6%肉桂醛含量的包裝紙包裝,置于25 ℃恒溫培養箱中保存,觀察記錄各處理包裝紙中面包開始發生霉變的天數。

在培養箱中保存第3 d,分別取每個包裝紙中的兩側和夾心面包各7 g,在無菌操作臺上剪碎混勻后置于均質袋中,參照GB 4789.2-2016在25 ℃恒溫培養箱中培養48 h后,測定面包中黑面包霉的菌落總數,所有樣品重復測試3次,抑菌率計算方法為:

抑菌率(%)=(空白對照菌落總數-處理菌落總數)/空白對照菌落總數×100

式(1)

表1 切片面包防霉應用實驗Table 1 Experiment on anti-mildew of sliced bread

1.2.6 活性包裝紙內切片面包中肉桂醛含量的測定 1.2.5中不同處理方式的面包在25 ℃恒溫培養箱中保存3 d后,進行肉桂醛含量的檢測。根據文獻方法[17]和預實驗結果,本研究肉桂醛含量測定方法如下:切片面包進行粉碎后,隨機稱取0.3 g樣品置于20 mL萃取瓶中,加入3.0 mL乙酸乙酯后用力振蕩3 min,靜置20 min,隨后乙酸乙酯提取物直接進行GC/MS分析。GC/MS分析在安捷倫公司配備有5975B inert XL MSD質譜檢測器的Hewlett-Packard 6890N氣相色譜質譜聯用儀上執行,采用HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),升溫程序:70 ℃保持1 min,以2 ℃/min升至85 ℃,隨后以5 ℃/min升至170 ℃,最后以5 ℃/min升至220 ℃,保持3 min;采用不分流進樣,進樣注射器和進樣口溫度250 ℃,進樣量為1.0 μL;載氣(99.999%,He),流速1.0 mL/min,壓力96.1 kPa。采用馬鞭草烯酮作為內標進行定量分析,通過連續測定切片面包中肉桂醛的含量來評估方法的可行性,直到檢測加標回收率達到98%以上,當天重復檢測標準偏差不超過2.4%時才開始進行正式樣品的檢測。根據內標物保留時間、峰面積As,樣品目標色譜峰保留時間、峰面積Ai,樣品量Mi和內標量Ms,應用內標法相對定量公式計算肉桂醛含量(Mn):

式(2)

1.3 數據處理

采用Excel表格進行數據統計和作圖,利用SPSS軟件對數據進行統計分析,兩個處理數據采用t檢驗進行比較,兩個以上處理數據采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)進行比較,p<0.05視為不同處理具有顯著性差異的判定標準。

2 結果與分析

2.1 活性包裝紙的抑菌活性

本研究測定了1%～6%肉桂醛石蠟涂層的抑菌活性包裝紙對培養基中黑面包霉的體外抑菌作用(n=10),與空白和陰性處理比較發現,隨著肉桂醛含量的增加,抑菌活性包裝紙的抑菌率也相應增加,涂層肉桂醛成分含量6%的抑菌活性包裝紙的抑菌率達到了100%,4%抑菌活性包裝紙的抑菌率為80%,2%抑菌活性包裝紙的抑菌率為20%,1%抑菌活性包裝紙的抑菌率為0(圖1)。本研究通過石蠟來添加肉桂醛有利于肉桂醛的緩慢釋放和增加肉桂醛的穩定性。結果表明,肉桂醛通過石蠟涂層可添加到包裝紙中,且制作的活性包裝紙具有很好的間接抑菌效果。有研究表明肉桂醛具有高的正辛醇/水分配系數,在普通的材料中具有溶解性、擴散性和很好的滲透性,可以通過控制其釋放行為發揮抗菌作用[18-19],本研究發現的其間接抑菌效果機理還有待進一步研究。

圖1 不同肉桂醛含量活性包裝紙體外抑菌試驗Fig.1 In vitro antibacterial test of active wrapping paper with different concentration of cinnamaldehyde

2.2 活性包裝紙面包防霉應用及其內面包抑菌活性

將新鮮制作的切片面包分別用對照包裝紙和1%～6%肉桂醛含量的包裝紙包裝,置于25 ℃恒溫培養箱中觀察結果,對照組包裝面包在第3 d就發生霉變了,而1%、2%、4%和6%肉桂醛含量的包裝紙中的面包分別在第3、第5、第15、第24 d才開始發生霉變。結果表明,肉桂醛顯著抑制了面包霉變的發生,延長了面包保存時間。肉桂醛對于食品中大多數真菌具有很好的抑制作用,其可通過損傷霉菌細胞質膜而進入細胞,使霉菌胞內大分子空間結構改變,生長繁殖和產毒代謝被破壞,從而抑制霉菌的生長和霉菌毒素的產生[14,20]。

通過測定保存3 d面包中的真菌含量,研究活性紙包裝面包的抑菌活性。結果表明(圖2),面包中霉菌孢子接種濃度為1.0×105CFU/mL時,4%和6%肉桂醛活性包裝紙對真菌具有64.0%和93.4%的抑菌率,而1%和2%肉桂醛活性包裝紙對真菌只有0.5%和4.2%的抑菌率;而面包中霉菌孢子接種濃度為1.0×106CFU/mL時,4%和6%肉桂醛活性包裝紙對真菌具有58.4%和83.2%的抑菌率,而1%和2%肉桂醛活性包裝紙對真菌只有0.2%和2.8%的抑菌率,抗菌活性與孢子接種濃度為1.0×105CFU/mL時沒有顯著差異,說明肉桂醛活性面包包裝紙的抑菌效果隨肉桂醛濃度的增加而增加,而接種真菌孢子濃度的初始濃度與抗菌活性之間沒有直接關系。通過肉桂醛對鐮刀菌的抑菌作用研究也發現肉桂醛的抑菌性能存在劑量-效應關系,抑菌效果隨肉桂醛濃度的增加而增加[21],而抑菌實驗中肉桂醛熏蒸法比直接接觸法的抑菌效率更高[15,17,22],所以本研究在面包包裝紙上添加含有肉桂醛的石蠟涂層,可以更好的抑制沒有和包裝紙直接接觸面包上的黑面包霉。

圖2 不同活性包裝紙包裝內面包的抑菌試驗Fig.2 Antibacterial test of packaged bread in different active wrapping paper

2.3 活性包裝紙內面包中的肉桂醛含量及其與抑菌作用的關系

肉桂醛對真菌的抑制作用主要發生在真菌菌絲生長期,所以在真菌發生的前3 d肉桂醛的濃度對于其抑制作用具有重要影響[23-24]。因此本文通過測定保存3 d一個包裝中兩側面包和夾心面包的肉桂醛含量來分析肉桂醛含量與其抑制作用的關系,結果發現面包中肉桂醛含量與活性包裝紙石蠟涂層中肉桂醛的含量呈正相關(R2=0.9625和0.9679),不同活性包裝紙包裝的夾心和兩側面包片中肉桂醛含量均沒有顯著性差異(圖3)。2%實驗組夾心和兩側面包中肉桂醛的最終濃度為19.7和22.7 μg/g,而4%實驗組夾心和兩側面包中肉桂醛的最終濃度為60.9和62.7 μg/g。結合圖2分析,說明肉桂醛對黑面包霉的抑制作用與面包中肉桂醛濃度有關,且初期的抑制濃度對抑制效果具有重要作用。接種真菌孢子的面包片放置在兩片沒有接種真菌孢子的面包中間,所以活性包裝紙與接種真菌孢子之間沒有直接接觸。綜合活性包裝紙體外抑菌結果圖1、實際面包抑菌結果圖2和面包中肉桂醛含量結果圖3分析表明,肉桂醛可通過非接觸發揮抑菌作用而非僅僅通過直接接觸發揮抑菌作用,且通過直接接觸擴散到面包上的肉桂醛的量很少。這一實驗結果為肉桂醛通過間接擴散從包裝紙中轉移到包裝內的面包中而發揮其抑菌活性提供了直接證據。

圖3 不同活性包裝紙包裝內兩側和夾心面包中肉桂醛濃度測定Fig.3 Concentration of cinnamaldehyde in lateral and centralslices bread in different active wrapping paper

3 結論

肉桂醛對黑面包霉具有很好的抑制作用,由固體石蠟涂制的活性包裝紙具有很好抗黑面包霉活性。石蠟涂層中肉桂醛含量越高,活性包裝紙和包裝內面包抗菌活性越強,石蠟涂層中肉桂醛含量達到4%是抑制黑面包霉,防治面包發霉的最小濃度,可達到延長面包貨架期的目的。本實驗中的活性包裝紙和黑面包霉沒有直接接觸,但其包裝內不同位置的切片面包均具有很好的抑菌作用,所以這可能是肉桂醛通過非接觸方式擴散至面包中而發揮抑菌作用的,但沒有更近一步的證據證明這種擴散方式。且這種非接觸方式的作用機理及肉桂醛擴散過程中是否對黑面包霉具有靶向作用還有待進一步研究。