超高效液相色譜法(UPLC)測定豬肉中9種生物胺含量

鄧 浩,尹青春,譚高好,徐 彬,譚淑君,朱琰婷,王運選

(1.海南省農業科學院農產品加工設計研究所,海南?？?570100; 2.海南省熱帶果蔬冷鏈研究重點實驗室,海南?？?570100; 3.海南省食品檢驗檢測中心,海南海口 570100; 4.襄陽市食品藥品檢驗檢測中心，湖北襄陽 441100)

生物胺是一類含氨基的具有生物活性的低分子量堿性有機化合物的總稱,主要包括色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、章魚胺、酪胺、亞精胺、精胺等[1]。食品中大部分的生物胺是在加工和貯藏過程中,食品表面的微生物釋放出氨基酸脫羧酶并催化氨基酸脫羧形成[2]。生物胺廣泛存在于各類食品中,尤其富含蛋白質和氨基酸的食品,含有生物胺較多的食品有:魚、肉及其制品、干酪及乳制品、酒及各類發酵產品、水果、蔬菜等。因此,生物胺的含量多少可作為判別食品細菌性腐敗程度的指標之一[3-5]。極少量生物胺是生物體內的正?；钚猿煞?在生物細胞代謝中發揮著重要的生理作用。但當人體內蓄積到一定程度的生物胺,會引起諸如頭痛、惡心、心悸、呼吸紊亂等過敏反應,嚴重者還會危及生命。歐盟及我國對食品中生物胺做了限量:歐盟規定鯖魚科樣品中組胺≤100 mg/kg,其他食品中的組胺≤100 mg/kg,酪胺不得超過100～800 mg/kg[6];我國規定高組胺魚類樣品中組胺≤40 mg/100 g;其他魚類樣品中組胺≤20 mg/100 g[7-8]。

目前,生物胺的檢測方法有液相色譜法[4-5]、超高效液相色譜法[6]、氣相色譜法、薄層色譜法、傳感器法和毛細管電泳法[9]、超高效液相色譜-串聯質譜法[10]、氣相色譜-串聯質譜法[11]等生物胺檢測方法。采用液相色譜法測定時,重復性好、檢測靈敏度高、定量分析準確,是國內外定量檢測食品中生物胺最常用的方法,也常用于檢測禽畜肉中生物胺的含量。但液相法往往需要柱前衍生,且普通液相法分離幾種物質所需時間較長,不適用于批量檢測;超高效液相色譜-串聯質譜法、氣相色譜-串聯質譜法等分離時間短,不需要柱前衍生,但儀器設備昂貴,所需耗材成本高;離子色譜分離時間長,部分生物胺成分不能檢測[4];氣相法具有分離效率高、分析速度快、選擇性好等優點,但樣品前處理復雜耗時,且對生物胺組分進行定性分析時,一般需要與質譜聯用才能獲得準確的結果,增加了設備的成本等。綜合以上方法的優缺點,本研究建立了超高效液相色譜法(Ultra performance liquid chromatography,UPLC)測定豬肉中9種生物胺的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丹磺酰氯GR 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;甲醇、乙腈 色譜級,德國Merck公司;乙酸銨 色譜級,Fisher Chemical;三氯乙酸(簡稱TCA) AR,國藥集團化學試劑有限公司;氫氧化鈉、NaHCO3、丙酮 AR,廣州化學試劑廠;氨水 AR,西隴化工股份有限公司;9種生物胺標準品及內標 詳見表1;市售豬肉 鄭華菜場2份,東門菜場2份,金鹿花園菜市場2份,城東菜市場2份,于2018年5月20～25日購買,放于-20 ℃冰箱儲藏。

表1 9種生物胺標準品及內標信息 Table 1 Standard and internal standard information of 9 biogenic amines

Waters 2695液相色譜(DAD和FLD(熒光檢測器))、Waters ACQUITY H UPLC? CLASS超高壓高效液相色譜儀(DAD(二極管陣列,下同)檢測器) 美國Waters公司;LC-20A液相色譜(DAD檢測器) 日本島津公司;Centrifuge 5804 R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;Mettler XS204十萬分之一分析天平 美國Mettler Toledo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準工作溶液的配制 準確稱取各生物胺標準物質10.0 mg(精確到 0.1 mg),甲醇溶解并定容至10.0 mL,配得濃度為1.0 mg/mL的單標溶液;準確吸取上述各單標溶液適當體積于100.0 mL容量瓶中,甲醇定容配得濃度為100.0 μg/mL的9種物質混標溶液;于4 ℃下避光保存。

1.2.2 儀器及色譜柱的選擇 UPLC法:本實驗采用Waters ACQUITY H UPLC? CLASS超高效液相色譜儀(DAD檢測器),ACQUITY BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色譜柱,流動相:10 mmol/L乙酸銨(A)-乙腈(B);梯度洗脫程序:0～7.0 min,40% A;7.1～11 min,15% A;11.1～13 min,40% A;流速:0.3 mL/min;進樣量3.0 μL;檢測波長為245 nm;柱溫35 ℃。以保留時間定性,峰面積百分比定量,內標法計算。

本實驗著重比較了Waters ACQUITY H UPLC? CLASS超高效液相色譜儀(DAD檢測器)、LC-20A島津(DAD檢測器)高效液相色譜儀、Waters e2695(DAD和FLD檢測器)高效液相色譜儀以及ACQUITY BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色譜柱、Agilent ZORBAX-AB C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)色譜柱、Waters XBrige C18(5 μm,4.6×250 mm)色譜柱對生物胺分離效果。

Waters ACQUITY H UPLC? CLASS超高效液相色譜儀(DAD檢測器)采用ACQUITY BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色譜柱,儀器條件按1.2.2敘述的UPLC法,進樣的9種生物胺的濃度均為50.0 μg/mL;

以下均采用文獻報道的洗脫方法[12-14],洗脫程序均按表2,柱溫35 ℃,進樣量10 μL,DAD檢測器檢測波長245 nm,熒光檢測器檢測波長為激發波長入ex:350 nm、吸收波長入em:520 nm,進樣的9種生物胺的濃度均為50.0 μg/mL。LC-20A島津液相(DAD檢測器)采用Agilent ZORBAX-AB C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)色譜柱;Waters e2695液相(DAD檢測器)采用Waters XBrige C18(5 μm,4.6×250 mm)色譜柱;Waters e2695液相(FLD檢測器)采用Waters XBrige C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)色譜柱。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.2.3 樣品提取及衍生化

1.2.3.1 樣品提取條件及衍生化條件 提取:準確稱取經磨碎的試樣2.00 g(精確到0.01 g)于50 mL離心管中,加入2 mL 100 μg/mL內標使用液,加入10 mL 5% TCA,漩渦振蕩5 min,于4 ℃冷凍離心機離心10 min,轉速10000 r/min,離心后取上清液。殘渣再加入5 mL 5% TCA重復提取一次,合并上清液,最后用5% TCA定容至20 mL,作為待測液。

衍生化:吸取生物胺樣品待測液及標準溶液1.0 mL置于10 mL離心管中,加入0.1 mL 100 μg/mL內標使用液,0.2 mL 2 mol/L NaOH溶液,0.3 mL飽和NaHCO3緩沖溶液,調節pH約為11,然后加入2 mL 10 mg/mL丹磺酰氯(溶于丙酮),于60 ℃反應15 min,立即加入0.2 mL氨水(25%)混勻,終止衍生反應,于暗處靜置20 min,用乙腈定容至10 mL,于4 ℃條件下10000 r/min離心3 min,取上清液過0.22 μm濾膜上機。

1.2.3.2 提取條件優化 按照1.2.3.1樣品提取步驟,根據文獻報道及國標的檢測方法進行優化,考察2%、5%、10% TCA提取液的提取效果[12-14]。

1.2.3.3 生物胺標準溶液及樣品的衍生化條件優化 按照1.2.3.1衍生化步驟,采用2 mol/L氫氧化鈉和飽和NaHCO3緩沖溶液調節提取液的酸堿體系的pH為pH5、7和11左右[14],確定衍生化的最優pH,比較不同溫度30、45、60 ℃進行水浴的衍生效果[15-17]。

1.3 流動相的優化

按照1.2.2 UPLC法的儀器條件,根據文獻[12-15]報道,以1.2.2 UPLC法的梯度洗脫程序和表3中A～D的洗脫程序進行調試,以確定最佳流動相,進樣的9種生物胺的濃度均為50.0 μg/mL。

表3 梯度洗脫程序 表3 Gradient elution program

1.4 線性范圍、檢出限和定量限

精密吸取5.0～100.0 μg/mL系列標準品工作溶液,按照1.2.2 UPLC法儀器條件進行測定,以9種生物胺質量濃度(X)為橫坐標,各生物胺與內標衍生物的峰面積比值(Y)為縱坐標,建立標準曲線,方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)是通過空白豬肉樣品加入不同濃度的標準工作溶液的方法測定的,其中當信噪比S/N ≥3.0時的含量為檢出限,S/N ≥10.0時的含量為定量限。

1.5 回收率實驗

本實驗以豬肉為基質做回收率實驗,取空白的豬肉樣品,9種生物胺的添加水平均為50、100、200 mg/kg,每個添加水平做6個平行,前處理方法及衍生化方法按1.2.3,儀器條件按1.2.2,進行檢測,計算回收率和相對標準偏差。

1.6 儀器精密度實驗

對質量濃度為50.0 μg/mL的9種生物胺標準品進行重復測定6次,計算相對標準偏差。

1.7 樣品測定

通過建立的UPLC法對市場購買的8份豬肉樣品中生物胺的種類和含量進行測定,每個樣品平行測定2次。

1.8 數據處理

本實驗采用Excel進行數據的結果計算,Waters儀器自帶的Empower和島津儀器自帶的LC solution數據處理及繪圖軟件進行數據分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 儀器及色譜柱的篩選

由圖1～圖2可知,LC-20A島津和Waters e2695采用DAD檢測器,9種生物胺均達到較好的分離,且峰型較好,靈敏度較高,說明LC-20A島津(DAD檢測器)和Waters e2695(DAD檢測器)以及所使用的色譜柱Agilent ZORBAX-ABC18和Waters XBrige C18色譜柱均可用于生物胺的檢測。由圖3可知:采用Waters e2695(FLD檢測器)檢測,9種生物胺各組分有較好的分離度,但是FLD檢測的組胺、章魚胺和酪胺的響應值較小;由圖4可知:采用Waters UPLC(DAD檢測器)檢測,9種生物胺組分在10 min內被全部洗脫出來,分離度良好,峰型較好,雜峰較少,靈敏度較高。

圖1 LC-20A島津高效液相DAD檢測器檢測的9種生物胺標品色譜圖Fig.1 Standard of 9 biogenic amines HPLC chromatogram of LC-20A DAD detector

圖2 Waters e2695高效液相DAD檢測器檢測的9種生物胺標品色譜圖Fig.2 Standard of 9 biogenic amines HPLC chromatogram of Waters DAD detector

圖3 Waters e2695高效液相FLD檢測器檢測的9種生物胺標品色譜圖Fig.3 Standard of 9 biogenic amines HPLC chromatogram of Waters FLD detector

圖4 Waters UPLC超高效液相DAD檢測器檢測的9種生物胺標品色譜圖Fig.4 Standard of 9 biogenic amines UPLC chromatogram of Waters UPLC DAD detector注:1:色胺;2:β-苯乙胺;3:腐胺;4:尸胺;5:組胺; 6:章魚胺;7:1,7-二氨基庚烷(內標);8:酪胺; 9:亞精胺;10:精胺;圖1～圖3，圖6～圖8同。

由圖1～圖3可知:LC-20A島津(DAD檢測器)和Waters e2695(DAD和FLR檢測器)及所使用的色譜柱均可對9種生物胺進行檢測,但每一針樣品均耗時30 min以上,在實際檢驗中,對于大批量豬肉類樣品中生物胺的檢測耗時過長,降低了檢測效率。因此,本文選擇采用Waters ACQUITY H UPLC? CLASS超高效液相色譜儀(DAD檢測器)進行生物胺檢測方法的優化。

2.2 提取條件及衍生化條件的優化

優化的提取及衍生條件為:豬肉樣品經5% TCA(三氯乙酸)兩次提取,取提取液1 mL中加入0.2 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液,0.3 mL飽和NaHCO3緩沖溶液,調節pH11左右,然后加入丹磺酰氯溶液2 mL,于60 ℃水浴衍生反應15 min,取出流水冷卻后,立即加入0.2 mL氨水(25%)混勻,終止衍生反應,于暗處靜置20 min,用乙腈定容至10 mL,于4 ℃條件下10000 r/min離心3 min,取上清液過濾膜上機?？瞻讟悠贰悠?、樣品加標的圖譜如圖5～圖7所示。在該條件下,9種生物胺分離度較好,每一針樣品的上樣時間比普通液相縮短近3倍,各組分靈敏度好,大大縮減了在實際應用中的時間成本,為快速測定豬肉類樣品中9種生物胺奠定了基礎。

圖5 空白樣品中生物胺的色譜圖Fig.5 UPLC chromatogram of biogenic amines in blank sample

圖6 豬肉樣品中生物胺的色譜圖Fig.6 UPLC chromatogram of biogenic amines in pork

圖7 豬肉樣品中加入生物胺標準品的色譜圖(10mg/kg)Fig.7 UPLC chromatogram of pork sample spiked biogenic amine at 10 mg/kg

2.3 流動相的優化

以表3洗脫程序A～D(表3洗脫程序A～D的出峰譜圖分別對應圖8A～D)及1.2.2 UPLC法梯度洗脫程序進行流動相的優化。由圖8可知,圖8A中β-苯乙胺出峰時間滯后,色胺和β-苯乙胺間有比較長一段平緩無雜質峰出現的時間,因此,將β-苯乙胺等洗脫時間提前,即在表3-A的洗脫程序基礎上,將2～4.6 min內有機相比例增大,調至表3-B洗脫程序,β-苯乙胺等的出峰時間提前,洗脫結果見圖8B;由圖8B可知:β-苯乙胺和腐胺間有比較長一段平緩無雜質峰出現的時間,所以調節表3-B的洗脫程序至表3-C洗脫程序;從圖8C可知:腐胺等的保留時間只縮短0.5 min,且峰型及分離度仍然不是很好,因此,調至表3-D的洗脫程序;由圖8D可知:生物胺各組分達到很好的分離度,且峰型對稱;從圖8A～D可知,精胺均未出峰,調洗脫程序至1.2.2 UPLC法梯度洗脫程序,將7.1～11 min時間段內的乙腈比例調大后,精胺出現,說明高比例有機相可將精胺洗脫下來。因此,相比表3的洗脫程度結果(結果見圖8A～D)，采用1.2.2 UPLC法梯度洗脫程序進行實驗(結果見圖4)。

圖8 流動相優化的譜圖Fig.8 Chromatogram of the flow phase optimization

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

UPLC法測定9種生物胺的保留時間、回歸方程、相關系數、檢出限以及定量限見表4。9種生物胺與內標衍生物的峰面積比值與其對應的標準濃度呈良好的線性關系,線性范圍為5.0～100.0 μg/mL,相關性系數r≥0.999。色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、章魚胺、酪胺、亞精胺、精胺檢出限分別為0.240、0.018、0.095、0.130、0.170、0.290、0.033、0.028、0.080 mg/kg,比國標GB 5009.208-2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》中規定的檢出限20 mg/kg低很多,說明本檢測方法靈敏度較高。

表4 9種生物胺的保留時間、回歸方程、相關系數、檢測限及定量限Table 4 Retention time,linear equation,correlation coefficient,limits of detection and quantification of 9 biogenic amines

2.5 回收率實驗

由表5可知,9種生物胺在豬肉中添加的回收率在70.70%～111.80%,相對標準偏差在0.33%～9.40%之間,說明本方法回收率和重復性較好。

表5 回收率實驗結果(n=6)Table 5 Experimental results of recovery rate(n=6)

2.6 儀器精密度實驗

由表6可知:RSD(n=6)≤3.72%,這說明儀器具有較好的精密度,適用于生物胺的檢測。

表6 精密度實驗結果(n=6)Table 6 Experimental results of precision(n=6)

2.7 樣品測定

由表7可知,不同豬肉樣品中含有的生物胺種類、含量及比例基本一致,豬肉中均含有精胺和β-苯乙胺,部分含有亞精胺和酪胺;有文獻報道:精胺和亞精胺是豬肉中的組成性胺類[18],β-苯乙胺也可能是在飼養豬時飼料中添加物質[19];酪胺與反映產品腐敗品質的微生物數量、pH等相關,可以作為判斷冷卻豬肉腐敗品質變化重要的指標。本樣品是分批次購買,且一直放置于-20 ℃儲存,部分檢測時已放置5 d左右,因此,部分豬肉可能出現少量微生物增加的趨勢,故部分豬肉中有酪胺檢出,與文獻報道一致[20]。

表7 豬肉樣品中生物胺的含量(mg/kg)Table 7 Biogenic amines contents of pork samples(mg/kg)

3 結論

本實驗建立了一種快速測定豬肉中9種生物胺的UPLC測定方法。樣品經5%三氯乙酸溶液提取后用10 mg/mL丹磺酰氯進行衍生,流動相為乙腈-10 mmol/L乙酸銨,采用梯度洗脫,流速0.3 mL/min,檢測波長245 nm。結果表明:采用5%三氯乙酸溶液提取,丹磺酰氯進行衍生,應用二極管陣列檢測器能滿足豬肉中生物胺的分析檢測要求。色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、章魚胺、酪胺、亞精胺和精胺能在10 min內得到良好分離,線性范圍為5.0～100.0 μg/mL(r≥0.999),色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、章魚胺、酪胺、亞精胺、精胺檢出限分別為0.240、0.018、0.095、0.130、0.170、0.290、0.033、0.028、0.080 mg/kg,比國標GB 5009.208-2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》中規定的檢出限20 mg/kg低很多。通過對8批市場購買的樣品進行檢測,其生物胺總量在(19.40±1.13)～(128.20±0.99) mg/kg,由于本樣品是分批次購買,且一直放置-20 ℃儲存,部分檢測時已放置5 d左右,因此檢測結果有差異。本實驗建立的方法操作簡單、靈敏度高、節省時間,且可同時測定9種生物胺的含量,其平均回收率在70.70%～111.80%之間,樣品回收率相對標準偏差在0.33%～9.40%之間,儀器精密度RSD(n=6)≤3.72%,滿足檢測需要,對于豬肉中生物胺的快速批量檢測有較大的實際應用前景,對我國開展食品中生物胺的風險技術評估和降低生物胺膳食攝入危險都具有重要參考意義。