皖北地區(qū)窖泥類芽孢桿菌發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)的研究

吳文睿,劉飛翔,方頌平,蒲順昌

(亳州學(xué)院生物與食品工程系,安徽亳州 236800)

濃香型白酒以其典型風(fēng)格,深受廣大消費(fèi)者喜愛,它占據(jù)著我國白酒市場(chǎng)份額的70%[1-2]。窖泥是濃香型白酒生產(chǎn)釀造過程中的基礎(chǔ)物質(zhì)之一,為釀酒微生物提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì),也是具有生香功能微生物的富集場(chǎng)所[3]。窖泥中長期馴化的微生物種群及其代謝產(chǎn)物相互制約、相互協(xié)調(diào)、相互作用,為酒體香味物質(zhì)的形成提供反應(yīng)底物,為濃香型白酒質(zhì)量和典型風(fēng)格的形成奠定基礎(chǔ)[4]。

近年來,隨著食品風(fēng)味各種分析儀器的快速發(fā)展,我國研究人員對(duì)白酒中的各種風(fēng)味物質(zhì)及其形成機(jī)理進(jìn)行了深入的研究。許多學(xué)者,從酒醅和窖泥中分離得到相關(guān)功能性微生物,并對(duì)其發(fā)酵后的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析,以探究其在白酒釀造中的作用。例如,鐘姝霞等[5]從醬香型酒醅中篩選出5株芽孢桿菌,并采用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)(GC-MS)對(duì)其發(fā)酵后代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析,結(jié)果表明:主要產(chǎn)物為3-羥基-2-丁酮,以及少量的2,3-丁二醇和酯類等芳香物質(zhì)。趙輝等[6]從白酒窖泥中篩選及鑒定了高產(chǎn)己酸的三株細(xì)菌,已應(yīng)用于窖池保養(yǎng)及人工窖泥培養(yǎng)。楊春霞等[7]從牛欄山二鍋頭酒醅中分離篩選出5株芽孢桿菌,并對(duì)其發(fā)酵后的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示其代謝產(chǎn)物均含有十幾種風(fēng)味物質(zhì),且含有許多重要的酯類物質(zhì)。

我國安徽北部地區(qū)由于季風(fēng)明顯,氣候溫和,光照充足,雨量適中,無霜期長,四季分明,春溫多變,夏雨集中,秋高氣爽,冬長且干的獨(dú)有的天然地理環(huán)境,聚集著許多的白酒生產(chǎn)基地,在香型類別上均屬于濃香型白酒,其中以古井、金種子、高爐家和文王等為代表[8]。我們已對(duì)皖北地區(qū)的窖泥微生物進(jìn)行分離,得到許多窖泥微生物的菌種,許多是濃香型白酒重要功能性微生物。目前對(duì)白酒的微生物研究多集中在芽孢桿菌、酵母等釀造功能菌上,對(duì)窖泥中類芽孢桿菌的研究較少,通過對(duì)類芽孢桿菌的研究,可探索類芽孢桿菌菌種代謝產(chǎn)物與酒中風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)選取其中分離得到的類芽孢桿菌屬Paenibacilluslautus(P.lautus)、Paenibacilluswynnii(P.wynnii)、Paenibacillustarimensis(P.tarimensis)進(jìn)行研究,采用固相微萃取法對(duì)三株類芽孢桿菌株的發(fā)酵液進(jìn)行萃取,然后采用GC-MS分析檢測(cè)其發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)的組成,通過分析具有產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)能力菌株的代謝產(chǎn)物,探求各菌種代謝產(chǎn)物與酒中風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

類芽孢桿菌菌種:P.lautus、P.wynnii、P.tarimensis從皖北地區(qū)窖泥中分離鑒定。

TOMY SX-70高壓滅菌鍋 日本TOMY;Heratherm IMH400-S生化培養(yǎng)箱 美國Heratherm;MaxQ 485HP震蕩培養(yǎng)箱 美國Thermo;Allegra 64R高速離心機(jī)、Agilent PC420固相微萃取儀 美國安捷倫科技有限公司;Waters I-Class/Xevo TQD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS) 美國沃特世科技有限公司(Waters);CAR/PDMS 75 μm頂空固相萃取頭 美國SUPELCO公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配方 菌種活化培養(yǎng)基:蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、葡萄糖3%、氯化鈉0.05%、硫酸銨0.09%、硫酸鐵0.01%、硫酸鎂0.03%、氯化鈣0.5%、酒醅浸提液、瓊脂2%、pH7.0。

種子培養(yǎng)培養(yǎng)基:蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、葡萄糖3%、氯化鈉0.05%、硫酸銨0.09%、硫酸鐵0.01%、硫酸鎂0.03%、氯化鈣0.5%、酒醅浸提液、pH7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基:糖化液(玉米、高粱、大米)9%、蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、硫酸銨0.09%、硫酸鎂0.03%、pH7.0。

1.2.2 發(fā)酵液的制備 菌種活化:將保藏菌種接種于菌種活化培養(yǎng)基斜面上,35 ℃條件下活化24 h。

種子培養(yǎng):從經(jīng)活化后的新鮮試管斜面上取兩環(huán)菌種,接種到裝有15 mL種子培養(yǎng)基的25 mL搖瓶中,在35 ℃,140 r/min條件下培養(yǎng)24 h,制備種子液。

發(fā)酵培養(yǎng):取上述種子液15 mL接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(250 mL的三角瓶,裝液量150 mL)中,在140 r/min,35 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h。以接種15 mL種子培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.2.3 發(fā)酵液的前處理 菌種發(fā)酵液GC-MS分析的前處理:吸取發(fā)酵液與無水乙醇按1∶1比例混合均勻后,靜置30 min,在10 ℃條件下離心,轉(zhuǎn)速3000 r/min,離心10 min,取上清液先進(jìn)行粗過濾,再用0.22 μm的水相濾膜過濾,得濾液,用移液管吸取濾液8 mL加入到頂空瓶中,稱取氯化鈉3.0 g加入到頂空瓶中,并加入一顆攪拌磁子,設(shè)置磁力攪拌器溫度為50 ℃,轉(zhuǎn)速400 r/min,PDMS萃取頭頂空萃取30 min。

1.2.4 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析 氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀分析條件:不分流流速0.9 mL/min;進(jìn)樣口溫度:230 ℃;升溫程序:35 ℃保持4 min,以2 ℃/min升溫到60 ℃不保持,以6 ℃/min 升溫到180 ℃保持15 min;色譜與質(zhì)譜接口溫度:230 ℃;電離方式:電子轟擊源(EI);檢測(cè)方式:全掃描模式;電離能量:70 eV。

1.3 數(shù)據(jù)處理

經(jīng)過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)樣分析后,使用儀器Chemstation數(shù)據(jù)處理軟件,對(duì)樣品全分析譜圖進(jìn)行解析,導(dǎo)出樣品中風(fēng)味物質(zhì)的峰面積,計(jì)算面積百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 整體風(fēng)味化合物分布情況

按照實(shí)驗(yàn)方法,將類芽孢桿菌屬的3株菌的發(fā)酵液和空白培養(yǎng)基經(jīng)固相微萃取等前處理后,用GC-MS分析其風(fēng)味化合物的種類以及相對(duì)含量,總離子色譜圖見圖1～圖4。由總離子色譜圖可知,3株類芽孢桿菌屬菌的發(fā)酵液中的風(fēng)味化合物種類數(shù)量明顯高于空白對(duì)照。

圖1 空白培養(yǎng)基氣質(zhì)分析總離子色譜圖Fig.1 GC-MS total ions chromatogram of blank medium

圖2 Paenibacillus wynnii發(fā)酵液氣質(zhì)分析總離子色譜圖Fig.2 GC-MS total ions chromatogram of flavor compounds in the fermentation of Paenibacillus wynnii

圖3 Paenibacillus tarimensis發(fā)酵液氣質(zhì)分析總離子色譜圖Fig.3 GC-MS total ions chromatogram of flavor compounds in the fermentation of Paenibacillus tarimensis

圖4 Paenibacillus lautus發(fā)酵液氣質(zhì)分析總離子色譜圖Fig.4 GC-MS total ions chromatogram of flavor compounds in the fermentation of Paenibacillus lautus

由圖5分析可知,三株類芽孢桿菌屬的發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)種類主要集中在酯類、醇類、醛酮類和雜環(huán)類四類上,這些化合物與白酒中的微量成分種類基本一致[9]。其中,P.wynnii和P.lautus發(fā)酵的風(fēng)味物質(zhì)中,酯類和醇類的相對(duì)含量較高;而P.tarimensis發(fā)酵的風(fēng)味物質(zhì)中,雜環(huán)類化合物的相對(duì)含量較高。酯類和醇類物質(zhì)是白酒中微量成分占比比較大,為濃香型白酒中主體香貢獻(xiàn)較大。雜環(huán)類(酚類、呋喃類等)化合物雖在白酒中的成分極微量,但其閾值往往較低,對(duì)白酒的典型風(fēng)格香味上仍有較高的貢獻(xiàn)[10]。

圖5 類芽孢桿菌屬發(fā)酵液的風(fēng)味化合物分布情況Fig.5 The distribution of flavor compounds in the fermentation by Paenibacillus

2.2 主要風(fēng)味物質(zhì)分析

由表1可知,P.wynnii、P.tarimensis和P.lautus的發(fā)酵液中分別鑒定出58、26和39種風(fēng)味化合物。P.wynnii主要發(fā)酵產(chǎn)物是3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二醇、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(4-乙烯基愈創(chuàng)木酚)、己酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯等,其產(chǎn)酯物質(zhì)較多,酯類物質(zhì)是酒中的主要的呈香物質(zhì),而且己酸乙酯是濃香型白酒的主體香[11]。P.tarimensis主要發(fā)酵產(chǎn)物是2,4-二叔丁基苯酚、3-羥基2-丁酮、2,3-丁二醇、2-甲氧基苯酚、2.3-二氫苯并呋喃、己酸乙酯、乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、香葉醇、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(4-乙烯基愈創(chuàng)木酚)等。P.lautu主要發(fā)酵產(chǎn)物是2,3-丁二醇、己酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、己酸己酯、棕櫚酸乙酯等,產(chǎn)酯物質(zhì)較多。酯類化合物是白酒中除乙醇和水以外含量最多的一類組分。它約占總組分含量的60%,白酒中酯類化合物多以乙酯形式存在。在白酒的香氣特征中,絕大部分是以突出酯類香氣為主的。在酒體中,一些含量較高的酯類,由于它們的濃度及氣味強(qiáng)度占有絕對(duì)的主導(dǎo)作用,使整個(gè)酒體的香氣呈現(xiàn)出以酯類香氣為主的氣味特征,并表現(xiàn)出某些酯原有的感官氣味特征。濃香型白酒中的已酸乙酯,在酒體中占有主導(dǎo)作用,使?jié)庀阈桶拙频南銡獬尸F(xiàn)出以己酸乙酯為主的香氣特征。

表1 類芽孢桿菌屬菌發(fā)酵液氣質(zhì)分析結(jié)果Table 1 The analysis of GC-MS results of flavor compounds in the fermentation by Paenibacillus

續(xù)表

P.wynnii和P.tarimensis的發(fā)酵產(chǎn)物中均有較高含量的3-羥基-2-丁酮,相對(duì)含量分別為12.65%和14.17%。3-羥基-2-丁酮又名乙偶姻,是令人喜愛的食用香料,具有特有的奶油香味,在酒中是一種重要的芳香成分,賦予酒的濃厚,可使酒產(chǎn)生優(yōu)良的風(fēng)味[12]。此外,許多研究表明3-羥基-2-丁酮是四甲基吡嗪的重要前體物質(zhì),并且在這兩株菌中的發(fā)酵液中均檢測(cè)到了四甲基吡嗪的存在,這可能是以3-羥基-2-丁酮為前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來[13-15]。P.wynnii、P.tarimensis和P.lautus均含有較高的2,3-丁二醇,其含量分別為22.21%、11.67%和40.30%。研究表明,2,3-丁二醇是白酒中重要的多元醇之一,是主要甜味芳香物質(zhì),能使酒醇厚綿甜,有自然感[16]。

P.tarimensis的發(fā)酵產(chǎn)物還含有較高的雜環(huán)類化合物,如2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(4-乙烯基愈創(chuàng)木酚,12.54%)、2-甲氧基苯酚(8.50%)、2.3-二氫苯并呋喃(7.04%)等。一直以來,酒中的酚類化合物被認(rèn)為是飲料酒中有重要貢獻(xiàn)的香氣物質(zhì)[17]。其中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚主要存在于玉米酒精發(fā)酵的揮發(fā)物中,其感官閾值很低,僅為0.3 mg/L,痕量存在時(shí)也能呈現(xiàn)發(fā)酵香氣、酚味、藥香味、丁香味或煙熏味、略帶甜味,是決定酒類、醬油、茶葉、干酪、咖啡等食品的主要香味成分,也是日化、醫(yī)藥、香精合成等行業(yè)較為常用的高檔香料之一[18-19]。白酒中含有3-羥基-2-丁酮、2.3—丁二醇,被認(rèn)為它是白酒質(zhì)量的重要成分,在白酒中起著緩沖、平衡的作用,能是酒產(chǎn)生優(yōu)良的酒香和綿甜的口味,同時(shí)白酒中3-羥基-2-丁酮及2.3-丁二醇是呈甜味物質(zhì),并有助香作用,特別是在回味上使之有醇厚感,能使酒醇厚綿甜,有自然感。

3 討論與結(jié)論

以皖北地區(qū)窖泥中的類芽孢桿菌屬菌P.wynnii、P.tarimensis和P.lautus為研究對(duì)象,通過檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),這三株菌株均是很好的窖泥功能菌。P.wynnii和P.lautus的發(fā)酵液中分別鑒定出58和39種風(fēng)味化合物,且以酯類物質(zhì)為主;P.tarimensis的發(fā)酵液中分別鑒定出26種風(fēng)味化合物,主要以具有芳香味雜環(huán)類化合物為主;此外,3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二醇和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚等也有較高相對(duì)含量,它們也均是白酒中的重要呈香呈味物質(zhì),這些菌產(chǎn)生的主要香氣成分是白酒重要的香味物質(zhì),對(duì)白酒是香氣貢獻(xiàn)是正向。因此,從窖泥中篩選到的類芽孢桿菌屬的發(fā)酵代謝產(chǎn)物與酒中主要風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)聯(lián)較大,研究結(jié)果可為進(jìn)一步深入研究濃香型白酒的風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)制、微生物代謝機(jī)理、發(fā)酵生產(chǎn)工藝及技術(shù)改進(jìn)等提供一定的理論和技術(shù)支持。