超高效液相串聯質譜檢測茶葉及茶飲料中咖啡因含量

秦 園,王惠芳,吳建兵,錢志榮,吳 梅,陳祝軍

(張家港市疾病預防控制中心,江蘇張家港 215600)

咖啡因(Caffeine)是從茶葉、咖啡果中提煉出來的一種黃嘌呤生物堿化合物[1],是一種中樞神經興奮劑,適度地使用有去除疲勞、興奮神經并恢復精力的作用,臨床上常用于治療昏迷復蘇和神經衰弱[2-3]。長期或過量地食用含咖啡因的食物或飲品會刺激中樞神經[4]、影響睡眠[5],甚至引起嬰幼兒早產[6-7]等;一但停用還會出現精神萎糜、渾身困乏等戒斷現象,危害人體健康[8-10]。因此,對不同產品及飲料中咖啡因含量快速、準確的測定,有助于人們科學、適量地攝入相關產品。

目前用于檢測咖啡因的方法有:薄層色譜法[11]、紫外分光光度法[12-14]、氣相色譜-質譜聯用法(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)[15]、高效液相色譜法(High performance lipid chromatography,HPLC)[16-20]及液相色譜串聯質譜法(Lipid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS)[21-22]。其中薄層色譜法步驟復雜、有毒溶劑用量多且為半定量法;紫外分光光度法靈敏度較低;液相色譜檢測周期長;氣相色譜-質譜聯用法無法直接測定,具有假陽性;液相串聯質譜檢測咖啡因的方法國內已有報道,陳彩云等[2]探究了液相串聯質譜法檢測巴西綠蜂膠制品中的咖啡因,而該方法用于檢測茶及茶飲料中咖啡因含量報道較少,且專屬性不夠強。

本文探究超高效液相串聯質譜法檢測咖啡因的具體實驗條件,并用于多種茶葉及茶飲料中咖啡因含量檢測。對茶葉中咖啡因含量的檢測方法進行補充,為證明該方法檢測食品中咖啡因含量的可行性提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

咖啡因標準品(GBW(E)082413,濃度為0.50 mg/mL) 北京海岸鴻蒙標準物質技術有限責任公司;甲醇、乙腈 色譜純,TEDIA公司;甲酸 色譜純,上海國藥集團化學試劑有限公司;去離子水 由去離子水器制得,美國Millipore公司;龍井 產地為浙江;碧螺春 產地為蘇州;普洱 產地為云南;金駿眉、鐵觀音、大紅袍 產地為福建;各茶飲料 均從市場自購。

UPLC/XEVO TQD液相色譜-串聯質譜儀、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)、Waters 2695液相色譜儀、SunFireTMC18色譜柱(2.1 mm×250 mm,5 μm) 美國Waters公司;一次性針頭過濾器(13 mm×0.22 μm) 上海安譜實驗科技股份有限公司;調節式電爐 上海華聯環境試驗設備公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 茶葉:直接稱取茶葉樣品0.500 g(精確至0.001 g),置于250 mL錐形瓶,加入100 mL水,沸水浴30 min,不時振搖,取出錐形瓶流水冷卻1 min,轉移至250 mL容量瓶中,加水定容,搖勻,靜置,取上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾后,備用。

茶飲料:稱取1.00 g(精確至0.001 g)樣品,加水定容至2 mL,搖勻,經0.22 μm微孔濾膜過濾后,備用[23]。

1.2.2 標準溶液 配制吸取咖啡因標準溶液200 μL于100 mL容量瓶中,用4%甲醇水溶液稀釋并定容,配制成1000 μg/L標準儲備液,4 ℃避光保存,備用。

1.2.3 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)美國Waters公司;柱溫為25 ℃;流動相:0.1%甲酸水溶液-乙腈(80∶20,v/v);流速為0.3 mL/min;分離時間5 min;進樣體積10 μL。

1.2.4 質譜條件 電噴霧電離離子源(ESI);掃描方式為正離子掃描;MRM監測模式;脫溶劑氣(N2)溫度:500 ℃;毛細管電壓:3.5KV;脫溶劑氣(N2)流速:700L/Hr;錐孔電壓:55V;碰撞氣為高純氬氣。

1.2.5 方法學考察

1.2.5.1 準確度實驗 方法準確度以加標回收率來判定,精確取出0.5 mL含已知咖啡因含量的金駿眉茶湯9份,分成3組,每組3份,于每組中加入0.5 mL咖啡因標準溶液,濃度分別為100、200、400 μg/L,按“1.2.3”色譜條件、“1.2.4”項質譜條件進行檢測,記錄峰面積,計算回收率。

1.2.5.2 精密度實驗 “1.2.5.1”項中的各加標樣品,按“1.2.3”色譜條件、“1.2.4”項質譜條件連續重復進樣6次,記錄峰面積,計算RSD。

1.3 數據處理

使用Excel軟件,計算實驗數據。SPSS 18.0軟件進行統計學分析,茶葉及茶飲料樣本結果以配對t檢驗進行統計分析,p<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 色譜條件建立

GB5009.139-2014《食品安全國家標準食品中咖啡因的測定》是檢測食品中咖啡因現行有效的方法,本實驗將該方法[23]中流動相條件:甲醇-純水(24∶76,v/v),分別應用于Waters 2695液相色譜儀和超高液相串聯質譜測定咖啡因標準溶液,其他色譜條件均參考GB5009.139-2014[23]。研究發現:甲醇-純水(24∶76,v/v)流動相可在液相色譜儀上很好的分離出咖啡因,基線穩定,對目標峰響應無影響(見圖1A),目標峰分離時間穩定為10.21 min;但該流動相用于超高效液相串聯質譜檢測咖啡因時,發現目標峰雖分離時間縮短(分離時間1.35 min),但其響應值易受基線干擾(見圖1B)且加標回收率不理想,說明甲醇-純水(24∶76,v/v)流動相條件不適用于超高效液相串聯質譜測定咖啡因。

圖1 UPLC-MS、LC檢測的咖啡因標準品色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard caffeine detected by UPLC-MS and LC注:A.液相色譜儀檢測咖啡因標準液; B.超高效液相串聯質譜檢測咖啡因標準液。

本文參考相關文獻[2,24-25]關于咖啡因的檢測,篩選出0.1%甲酸水溶液-乙腈(80∶20,v/v)流動相進行等度洗脫用于超高液相串聯質譜檢測咖啡因,實驗結果顯示:0.66 min目標峰即出現,響應值高、峰形好且不受基底干擾,能夠準確分離和定量咖啡因(見圖2),優于國標法[23]6.263 min出峰時間,因此將0.1%甲酸水溶液-乙腈(80∶20,v/v)流動相作為后續實驗條件。

圖2 UPLC-MS檢測的咖啡因標準品多反應監測色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of standard caffeine detected by UPLC-MS

2.2 質譜條件優化

根據咖啡因的分子結構,本實驗采用正離子(ESI+)作為離子化模式。質譜條件優化采用自動進樣方式,將濃度為500 μg/L的咖啡因標準液以10 μL/min的速度注入質譜系統,在ESI+模式下,通過Q1全掃描找出母離子。實驗結果顯示,咖啡因在ESI+模式下有較高的響應值。同時考查脫溶劑氣(N2)溫度、毛細管電壓、脫溶劑氣(N2)流速、錐孔電壓對離子強度的影響,并利用儀器自動優化目標化合物的碰撞能,最終選出母離子、兩個峰度較大的特征性子離子和最優碰撞能參數,詳見表1。

表1 咖啡因MRM參數Table 1 Parameters of Caffeine in multiple reaction monitoring(MRM)

2.3 方法學驗證

2.3.1 檢出限與標準曲線 以1000 μg/L咖啡因標準液為初始溶液,通過倍比稀釋法,用純水分別稀釋成2、5、50、500、1000 μg/L的工作液,經0.22 μm微孔濾膜過濾,進樣檢測,以目標峰響應值為三倍信噪比(S/N=3)時相對應的工作液濃度作為該方法的檢出限。實驗結果顯示:本方法中咖啡因的檢出限為2.0 μg/L,優于咖啡因國標法[23]70 μg/L的檢出限。

以咖啡因濃度分別為2、5、50、500、1000 μg/L的工作液進行實驗。以溶液濃度(x,μg/L)為橫坐標,各濃度對應的色譜峰面積(y)為縱坐標,進行線性回歸計算,繪制標準曲線(見圖3)。線性方程:y=40.3738x-18.1993,線性相關系數(r):0.9969,濃度范圍在2.0～1000 μg/L之間線性關系良好。

圖3 咖啡因標準曲線Fig.3 Standard curve of caffeine

2.3.2 準確度和精密度 實驗計算結果顯示:不同標準液添加水平下,茶樣品中咖啡因的回收率為90.2%～103.9%,表明該方法測定咖啡因含量的準確度良好;不同濃度標準液添加水平下,茶樣品中咖啡因含量的相對標準偏差為1.00%～3.00%,表明該方法測定咖啡因含量的精密度良好。各水平加標回收率和相對標準偏差見表2。

表2 UPLC-MS法檢測咖啡因加標回收率和RSD測定結果Table 2 Precision and recoveries of UPLC-MS examining caffeine

2.4 實際樣品檢測

以本實驗建立的超高效液相串聯質譜法以及國標液相色譜法對綠茶、紅茶、烏龍茶茶葉及4種茶飲料中的咖啡因含量進行測定,每個樣品重復3次。實驗結果顯示:茶葉與茶飲料中均有咖啡因檢出,茶葉中咖啡因含量在4.38～13.31 mg/g,茶飲料中咖啡因含量在0.07～0.16 mg/g,茶葉較茶飲料中咖啡因的含量高;紅茶中咖啡因含量略低于綠茶、烏龍茶茶葉中咖啡因含量(見表3),這可能與不同茶葉的產地、制作方式等有關。

表3 兩種方法測定茶葉及茶飲料中咖啡因含量Table 3 Detect caffeine in different tea and tea drinks with two

兩種檢測方法所得咖啡因含量結果經配對t檢驗統計分析(t=-0.820;p=0.433>0.05),無顯著性差異;且UPLC-MS法及國標法檢測咖啡因含量RSD分別為:2.05%～3.75%、1.18%～3.19%(表3),經配對t檢驗統計分析(t=1.897;p=0.09>0.05),無顯著性差異;表明超高效液相串聯質譜法檢測咖啡因含量準確性可靠。

3 結論與討論

本研究結果顯示:超高液相串聯質譜法檢測咖啡因的檢出時間為0.66 min;檢出限為2.0 μg/L;線性濃度范圍:2.0～1000 μg/L,相關系數(r)為0.9969;樣品加標回收率達90.2%～103.9%;相對標準偏差在1.00%～3.00%之間(n=6)。與國標法[23]相比,本法具有檢測時間短、靈敏度高等特點。

本文建立了超高液相串聯質譜法對不同茶葉及茶飲料中的咖啡因含量測定的方法。與國標色譜法及現有其他檢測方法相比[11-22,24-29],其檢測速度、靈敏度均具有明顯優勢;且準確度、精密度、回收率均符合食品檢測相關要求[30],可用于實際樣品的檢測;且該法對茶葉及茶飲料中咖啡因含量檢測結果及RSD與國標法相比無統計學差異,結果準確可靠。該方法為實際情況下快速檢測樣品中咖啡因含量提供了高效、可靠的新方法。