鷹嘴豆醇提物降血糖作用研究

王德萍，安馨，魚曉敏，于睿，王興婷，江巖

（1.新疆大學生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊830046；2.成都醫學院檢驗醫學院四川省動物源性食品獸藥殘留防控技術工程實驗室，四川成都610050）

鷹嘴豆（Cicer arietinum L.）因形如鷹嘴，故名鷹嘴豆，在全球是僅次于大豆的消費豆類[1-3]。《維吾爾藥志》記載，鷹嘴豆具有“清除異常體液，開通體液閉阻，調節機體等作用”，用于身體瘦弱、食欲不振、皮膚瘙癢及糖尿病等疾病的治療[4]。祖國中醫認為，鷹嘴豆“味甘、性平、無毒”，具有補中益氣、溫腎壯陽功效，享有“長壽豆”的美譽，在糖尿病、高脂血癥等慢性疾病的防治具有悠久的歷史[5-6]。

糖尿病發病率逐年升高且愈來愈年輕化，長期服用西藥會造成機體胰島素受體敏感性降低，產生胰島素抵抗等一系列毒副作用[7]。從天然藥食兩用植物中制備高效、安全、低毒的降血糖藥物具有很好的前景。

新疆木壘縣是國內最大鷹嘴豆種植基地，但其研發仍處于豆粉等低附加值農產品加工，基礎研究滯后。本文將鷹嘴豆醇提物喂飼糖尿病小鼠4 周，測定血糖、血清胰島素水平等指標，觀察胰腺組織病理變化，探討鷹嘴豆醇提物降血糖效應。以期促進新疆特色植物資源鷹嘴豆開發利用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級昆明種小鼠：新疆醫科大學動物實驗中心提供，生產許可證號：SCXK（新）2016-0003，52 只，雄性，體重（20±2）g，新疆醫科大學動物實驗中心飼養，自由進食、飲水。

1.2 試劑與儀器

鏈脲佐菌素：Sigma 公司；胰島素酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 測試盒：廣州威佳科技公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、總超氧化物歧化酶（totalsuperoxide dismutase，T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒：南京建成生物研究所。

S-752 紫外可見分光光度計：上海菁華科技公司；RT-6100 RayTo 酶標分析儀：深圳雷杜生命科技公司。

1.3 方法

1.3.1 鷹嘴豆乙醇提取物（醇提物）制備與成分測定

將鷹嘴豆粉碎，過40 目篩，石油醚回流脫脂，干燥。在乙醇濃度 50%、提取溫度 50 ℃、液料比 30∶1（mL/g）的條件下浸提鷹嘴豆，重復提取2 次，收集上清液，旋轉蒸發濃縮，真空冷凍干燥得鷹嘴豆醇提物。

分別采用蒽酮-硫酸法[8]、三波長紫外分光光度法[9]、香草醛-高氯酸比色法[10]、考馬斯亮藍法[11]測定鷹嘴豆醇提物中多糖、異黃酮、皂苷及蛋白質的含量。參照GB 5009.3-2010《食品安全國家標準食品中水分的測定》直接干燥法測定水分；參照GB 5009.10-2003《食品安全國家標準植物類食品中粗纖維的測定》稱重法測定粗纖維；參照GB/T 5009.6-2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》索氏抽提法測定粗脂肪。

1.3.2 建立糖尿病小鼠模型

取健康、雄性昆明種小鼠52 只，在實驗環境下給予基礎飼料，適應性喂養一周。隨機選取12 只作為空白對照組，給予緩沖液，其余40 只小鼠腹腔注射streptozocin 溶液[180 mg/（kg·d·BW）]，72 h 后測體重，尾尖取血測定空腹血糖，血糖值≥16.7 mmol/L 為造模成功。

1.3.3 動物實驗分組

A 組：空白對照組（12 只）；40 只糖尿病小鼠按體重隨機分為 5 組，每組 8 只：B 組：模型對照組；C 組：陽性藥物對照組（二甲雙胍）；D 組：鷹嘴豆醇提物低劑量組；E 組：鷹嘴豆醇提物中劑量組；F 組：鷹嘴豆醇提物高劑量組；每組8 只。飼養環境溫度22 ℃～27 ℃，相對濕度 50%～70%，12 h 明暗交替，每籠 6 只，自由進食、飲水。A 組和B 組灌胃等體積蒸餾水；C～F 組分別灌胃不同劑量的受試物，共計4 周。

表1 動物實驗分組情況Table 1 Experiments of mice grouping

1.4 指標測定

1.4.1 小鼠血糖、血清胰島素水平測定

尾尖取血測定小鼠空腹血糖值。采用ELISA 法測定血清胰島素水平，用酶標儀在450 nm 波長下測定吸光度OD 值，計算樣品濃度。并按公式1、2 計算穩態模型的胰島素抵抗指數（homeostatic model assessment insulin resistance index，HOMA-IR）、胰島素敏感性指數（quantitative insulin sensitivity check index，QUICKI）。

式中：FBG 為空腹血糖水平，mmol/L；FINS 為胰島素水平，mIU/mL。

1.4.2 小鼠血清氧化-抗氧化水平測定

根據試劑盒說明書測定小鼠血清中抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT 活性及過氧化脂質 MDA 含量，評價各組小鼠機體氧化-抗氧化水平。

1.4.3 小鼠肝臟、胰腺病理切片觀察

取小鼠肝臟、胰腺組織，采用甲醛固定；常規洗滌、脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色（hematoxylineosinstaining，HE）染色，光鏡下觀察組織病理變化。

1.5 數據處理和統計分析

2 結果

2.1 鷹嘴豆醇提物成分分析結果

鷹嘴豆醇提物成分分析結果見表2。

表2 鷹嘴豆醇提物成分分析結果Table 2 Composition of chickpea ethanol extracts

2.2 鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠血糖水平的影響

鷹嘴豆醇提物對小鼠血糖水平的影響見表3。

表3 鷹嘴豆醇提物對小鼠血糖水平的影響Table 3 Effects of chickpea ethanol extracts on diabetic mice's blood glucose level

表3 顯示，空白組小鼠與模型組糖尿病小鼠血糖水平在實驗期間均較穩定。實驗結束時，鷹嘴豆醇提物低、中、高組血糖水平分別為模型組的83.4%、60.0%、67.9%（P＜0.05），以中劑量組降血糖效果最為顯著，該組血糖水平與陽性藥物二甲雙胍十分接近，無明顯差異（P＞0.05）。

2.3 鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠血清胰島素水平的影響

鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠血清胰島素水平的影響見表4。

表4 鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠血清胰島素水平的影響Table 4 Effects of chickpea ethanol extracts on diabetic mice's blood insulin levels

表4 顯示，模型組糖尿病小鼠血清胰島素水平是空白組的2.74 倍（P＜0.05），呈胰島素抵抗狀態。而鷹嘴豆醇提物各組胰島素水平、胰島素抵抗指數呈下降趨勢，而胰島素敏感指數明顯增強（P＜0.05），以中劑量組效果最好，胰島素水平、胰島素抵抗指數及胰島素敏感指數分別是模型組的39.74%、31.09%及1.22 倍。

2.4 鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠血清氧化-抗氧化水平的影響

鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠血清氧化-抗氧化水平的影響見表5。

表5 鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠血清氧化-抗氧化水平的影響Table 5 Effects of chickpea ethanol extracts on diabetic mice's sera antioxidants activities

由表5 可知，與空白組相比，模型組MDA 含量升高，抗氧化酶活性不同程度降低（P＜0.05）。鷹嘴豆醇提物干預4 周后，糖尿病小鼠體內抗氧化酶活性均有所提高，以中劑量組作用較為明顯，T-SOD、GSH-Px、CAT 活性及 MDA 含量分別是模型組的 1.09、1.03、1.36 倍及76.4%。

2.5 鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠肝臟組織、胰腺組織的影響

鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠肝臟組織影響見圖1。

圖1 鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠肝臟組織影響的形態學觀察（HE染色 40×10）Fig.1 Effects of chickpea ethanol extracts on diabetic mice's liver morphology（HE staining 40×10）

圖1 顯示，空白組小鼠肝細胞形態、大小正常，核內染色質均勻。模型組糖尿病小鼠肝細胞腫大壞死，伴有脂肪空泡，出現脂肪變性。鷹嘴豆醇提物各組糖尿病小鼠肝細胞脂肪變性呈現不同程度的改善，以中劑量組作用最為明顯，該組糖尿病小鼠肝細胞形態、結構趨于正常，脂肪空泡明顯減少。

鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠胰腺組織影響見圖2。

圖2 鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠胰腺組織影響的形態學觀察（HE 染色 40×10）Fig.2 Effects of chickpea ethanol extracts on diabetic mice's pancreas morphology（HE staining 40×10）

圖2 顯示，空白組小鼠胰島細胞數量較多，胞漿致密，細胞完整性好。模型組糖尿病小鼠胰島細胞數量減少，排列紊亂，胞漿萎縮明顯，出現條帶狀空白區。鷹嘴豆醇提物各組糖尿病小鼠胰島細胞形態與結構呈現不同程度的改善，以中劑量組作用最為明顯，該組糖尿病小鼠胰島細胞體積較大，形態相對規則，胞質豐富，結構與空白組相似。

3 結論與討論

正常機體受胰島β 細胞和肌肉、脂肪等胰島素敏感組織構成的反饋環對血糖進行調控。當胰島素分泌不足時，肌肉、脂肪等外周胰島素效應細胞對葡萄糖攝取能力下降，造成胰島素抵抗，血糖將維持在較高水平[12-13]。因此，改善胰島素抵抗作用，促進效應細胞對葡萄糖利用，可以達到降血糖效果。大量研究證實，氧化應激損傷、過多的游離脂肪酸均可誘發胰島素抵抗[14]。天然產物中的黃酮、多糖、皂苷等化合物，可通過清除自由基、調節血脂等，多途徑改善胰島素抵抗現象，促進效應細胞對葡萄糖利用，可以達到降血糖效果[15-17]。

薛峰[18]研究表明，鷹嘴豆異黃酮可通過增強機體抗氧化酶活性，清除自由基及過氧化物產物，減輕細胞氧化損傷，促進胰腺等功能恢復，從而增強機體對葡萄糖攝取利用，發揮降血糖效應。凱賽爾[19]用鷹嘴豆總皂苷干預糖尿病大鼠，大鼠的胰島形態趨于規則，胰島細胞有所增加，提示鷹嘴豆總皂苷通過修復受損胰島細胞，促進胰島素分泌，從而發揮其降血糖作用。趙堂彥等[20]報道鷹嘴豆水提物中的異黃酮與皂苷在體外對α-葡萄糖苷酶具有較強的抑制作用。傅建云等[21]用鷹嘴豆多糖干預糖尿病小鼠后，可提高小鼠體內抗氧化酶活力，清除脂質過氧化物，修復四氧嘧啶對小鼠胰島損傷；并且增強肝臟、肌肉等效應細胞對胰島素敏感性，減輕胰島素抵抗，通過多途徑發揮降血糖效應。

本研究結果表明，鷹嘴豆醇提物明顯降低鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠血糖水平，減輕胰島素抵抗，增強胰島素敏感性，增強機體抗氧化酶活性。綜合上述學者關于鷹嘴豆降血糖效應研究，本實驗鷹嘴豆醇提物中的異黃酮、多糖、皂苷等生物活性物質發揮了降血糖效應，可能的作用機理如下：（1）提高機體抗氧化酶活性：清除自由基，減輕鏈脲佐菌素引發氧化損傷，修復肝臟、胰島受損結構與功能，促進胰島素分泌，發揮其降血糖效應。（2）上調胰島素信號通路基因表達：鷹嘴豆醇提物可能通過促進胰島素信號通路中關鍵基因表達，促進胰島素分泌，并增強肌肉、肝臟等效應細胞對胰島素的敏感性，減輕胰島素抵抗，促進效應細胞對葡萄糖的攝取與利用，發揮其降血糖效應。鷹嘴豆醇提物降血糖作用機制仍有待深入研究。