蕎麥葉大百合總黃酮提取工藝及抗氧化活性研究

秦晶晶，錢慧琴，趙媛，魏婧，魏琬絜，閆福林，2，*

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453000）

蕎麥葉大百合（Cardiocrinum cathayanum）屬于為百合科（Liliaceae）百合屬（Lium）多年生單子葉植物，是國(guó)家衛(wèi)生部審批通過的第一批藥食兩用植物之一[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，百合具有抗氧化、消炎、抗疲勞、抗抑郁、降血糖、改善呼吸功能等作用，百合主要化學(xué)成分為黃酮、多糖、皂苷，生物堿物質(zhì)[4]。其中黃酮類化合物是廣泛存在于植物界的一大類天然產(chǎn)物，酮類化合物具有多種生物活性，如抗氧化、抗炎、抗病毒、強(qiáng)心、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗衰老和抗腫瘤等作用[5-10]。其中最為重要的是它能減少自由基形成和清除自由基的抗氧化活性，還具有抗脂質(zhì)過氧化作用，是一類值得深入研究的天然有機(jī)抗氧化劑[11]。

目前，尚未有蕎麥葉大百合中總黃酮提取工藝及其抗氧化性的研究報(bào)道，因此，本研究以河南南陽桐柏縣為產(chǎn)地的蕎麥葉大百合作為研究對(duì)象，通過乙醇提取蕎麥葉大百合總黃酮，以總黃酮提取率（mg/g）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響，并在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行了四因素三水平正交試驗(yàn)，從而優(yōu)化蕎麥葉大百合總黃酮提取工藝。由于黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化作用，因此在蕎麥葉大百合總黃酮的最佳提取工藝條件下通過DPPH 試驗(yàn)來初步研究其抗氧化活性，以期為蕎麥葉大百合的綜合利用和提取蕎麥葉大百合黃酮作為天然食品抗氧化劑等提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

蕎麥葉大百合采自南陽桐柏縣，經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院藥學(xué)院中藥教研室閆福林教授鑒定為百合科大百合屬的地上部分，自然晾干，試驗(yàn)前60 ℃烘至恒重，粉碎，過40 目篩，備用。蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-201408）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；DPPH（CAS：1898-66-4）：東京化成工業(yè)株式會(huì)社；95 %乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH 等試劑均為分析純：天津市德恩化學(xué)試劑有限公司。

FA1004A 電子分析天平：上海象平儀器儀表有限公司；SG-4054 型數(shù)控精密恒溫水浴鍋：上海碩光電子科技有限公司；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；R206 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；SHZ-3 型循環(huán)水式真空泵：鄭州杜甫儀器廠；101-8 型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱：江蘇金壇市佳美儀器有限公司；T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取蘆丁對(duì)照品25 mg，置于50mL容量瓶中，加入少量95%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻即得蘆丁對(duì)照品溶液（5 mg/mL）。精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液 0.0 、0.2 、0.4、0.6 、0.8、1.0、1.2 mL，分別置于 10 mL具塞試管中，各加水至5.0 mL，分別加入5%亞硝酸鈉0.6 mL，搖勻，放6 min，加入10%硝酸鋁0.6 mL，搖勻后放置6 min，加入4%NaOH 3.0 mL，加水至刻度，搖勻后放置15 min。以第一管做空白，于506 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度A[12]，以蘆丁濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸收度A 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.070 2x+0.001 3，R2=0.999 7。

1.2.2 樣品總黃酮的測(cè)定

稱取蕎麥葉的大百合粉末2.5 g，經(jīng)抽濾得到提取物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后溶解定容至25mL容量瓶中，搖勻，備用。按“1.2.1”項(xiàng)方法測(cè)吸光度，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總黃酮含量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

按“1.2.1”方法，研究單因素乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%），提取溫度（40、50、60、70、80 ℃），料液比[1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）]，提取時(shí)間（10、20、30、40、50 min）對(duì)蕎麥葉大百合總黃酮的影響。

1.2.4 最佳工藝條件選擇

為了獲得以乙醇作為溶劑，回流提取蕎麥葉大百合黃酮的最佳工藝條件，在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以蕎麥葉大百合總黃酮提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，具體因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)的因素與水平Table 1 The factors and levels of L9（34）orthogonal experiment

1.2.5 蕎麥葉大百合總黃酮對(duì)DPPH 自由基清除能力的測(cè)定

蕎麥葉大百合濃縮液加無水乙醇配制成質(zhì)量濃度分別為 8、16、24、32、40、48、64、72、80 μg/mL 的樣品溶液。參考文獻(xiàn)[13]，在10mL試管中分別加入2 mL的1.3×10-5mol/L DPPH 溶液和2mL的不同濃度的各樣品溶液，密封，避光反應(yīng)30 min，于517 nm 處測(cè)定各樣品溶液的吸光度為A1，同時(shí)以等量乙醇溶液作為空白對(duì)照，并且平行測(cè)定用乙醇溶液作參比時(shí)的吸光度A2（即為2mL的1.3×10-5mol/L DPPH溶液加入2mL的無水乙醇溶液），測(cè)定2mL的無水乙醇溶液和2 mL不同濃度的各樣品液混合液的吸光度為A0。根據(jù)下面的公式計(jì)算清除率及EC50。

式中：A2表示2 mLDPPH 中加入2mL的無水乙醇的吸光度；A1表示2 mLDPPH 中加入2mL各樣品溶液的吸光度；A0表示2mL無水乙醇中加入2mL各樣品液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用 SPASS20.0、Microsoft Excel 2007 進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同乙醇濃度對(duì)蕎麥葉大百合黃酮提取工藝的影響

不同乙醇濃度對(duì)蕎麥葉大百合黃酮提取工藝的影響見圖1。

圖1 不同乙醇濃度對(duì)蕎麥葉大百合黃酮提取工藝影響Fig.1 The effects of ethanol concentration on extraction quantity of total flavonoids from Cardiocrinum cathayanum

由圖1 可知，乙醇濃度為80%時(shí)，黃酮提取率最高為11.11 mg/g，當(dāng)乙醇濃度為50%～80%時(shí)，所提取黃酮質(zhì)量隨著乙醇濃度增大而增加。而當(dāng)乙醇濃度＞80%時(shí)，黃酮的質(zhì)量隨濃度增加而減小，其原因可能是因?yàn)殡S著乙醇濃度增加，細(xì)胞內(nèi)外濃度差增加，從而增加提取黃酮質(zhì)量。但當(dāng)乙醇超過80%以后，使有些醇溶性雜質(zhì)、色素增多，這些雜質(zhì)會(huì)與黃酮競(jìng)爭(zhēng)溶劑，導(dǎo)致黃酮類化合物的溶解度降低。因此，選擇乙醇濃度為80%優(yōu)化黃酮提取。

2.1.2 不同提取溫度對(duì)蕎麥葉大百合黃酮提取工藝的影響

不同提取溫度對(duì)蕎麥葉大百合黃酮提取工藝的影響見圖2。

圖2 不同溫度對(duì)蕎麥葉大百合黃酮提取工藝影響Fig.2 The effects of extraction temperature on extraction quantity of total flavonoids from Cardiocrinum cathayanum

由圖2 可知，提取溫度為80 ℃時(shí)，黃酮提取率最高為10.91 mg/g，提取黃酮質(zhì)量隨著乙溫度的增高而增高，可能是由于蕎麥葉大白合中黃酮類化合物極性小，溶解度低，因此增加溫度時(shí)使其溶解，而且由于80%乙醇濃度的沸點(diǎn)約為80 ℃，因此選擇提取溫度為80 ℃優(yōu)化黃酮提取。

2.1.3 不同料液比對(duì)蕎麥葉大百合黃酮提取工藝的影響

不同料液比對(duì)蕎麥葉大百合黃酮提取工藝的影響見圖3。

圖3 不同料液比對(duì)蕎麥葉大百合黃酮提取工藝影響Fig.3 The effects of material-liquid ratio on extraction quantity of total flavonoids from Cardiocrinum cathayanum

由圖3 可知，料液比為 1∶10（g/mL）時(shí)黃酮提取率最高，為 10.11 mg/g；當(dāng)料液比為 1∶5（g/mL）～1∶10（g/mL）時(shí)，所提取黃酮質(zhì)量隨著溶液體積增大而增加。其原因可能是剛開始隨著溶液體積增加，蕎麥葉大百合顆粒與乙醇之間的接觸面增加，提高了黃酮類化合物像溶劑中轉(zhuǎn)移的擴(kuò)散系數(shù)，使得更多的黃酮類化合物轉(zhuǎn)移到提取溶劑中。而當(dāng)料液比為 1∶10（g/mL）～1∶40（g/mL）時(shí)，所提取黃酮質(zhì)量隨著溶液體積增大反而降低。可能是由于隨著溶液體積在繼續(xù)增加，由于大量溶質(zhì)溶出、部分黃酮類化合物與溶劑長(zhǎng)時(shí)間接觸導(dǎo)致結(jié)構(gòu)破壞所致的。因此選擇料液比為1∶10（g/mL）時(shí)優(yōu)化黃酮提取。

2.1.4 不同提取時(shí)間對(duì)蕎麥葉大百合黃酮提取工藝的影響

不同提取時(shí)間對(duì)蕎麥葉大百合黃酮提取工藝的影響見圖4。

圖4 不同提取時(shí)間對(duì)蕎麥葉大百合黃酮提取工藝影響Fig.4 The effects of extraction time on extraction quantity of total flavonoids from Cardiocrinum cathayanum

由圖4 可知，提取時(shí)間為30 min 時(shí)，黃酮提取率最高，為10.01 mg/g。當(dāng)提取時(shí)間為10 min～30 min 時(shí)，黃酮含量隨著提取時(shí)間增加而增加。超過30 min 時(shí)，黃酮含量隨著提取時(shí)間反而降低。其原因可能是因?yàn)殡S著提取時(shí)間延長(zhǎng)，溶劑與蕎麥葉大百合顆粒充分接觸，使其里面的黃酮類化合物充分溶出，從而使黃酮含量增高；但是當(dāng)一定溫度時(shí)，時(shí)間越久，由于溶劑中乙醇揮發(fā)，導(dǎo)致提取溶劑極性增加，根據(jù)相似相容原理，極性小的黃酮類化合物反而析出，從而導(dǎo)致黃酮類化合物含量降低。因此選擇提取時(shí)間為30 min 時(shí)優(yōu)化黃酮提取。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)結(jié)果分析見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析Table 2 Visual analysis of orthogonal experiment results

由表2 可知，R 值越大，說明該因素的水平變動(dòng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響越大，蕎麥葉大百合黃酮提取的4 個(gè)因素影響大小順序?yàn)榱弦罕龋–）＞乙醇濃度（A）＞提取溫度（B）＞提取時(shí)間（D）。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis tables

方差分析表3 顯示：料液比對(duì)黃酮提取率的影響存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而提取溫度和提取溶劑對(duì)黃酮提取率的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（0.05＜P＜0.1）。綜合考慮黃酮的最佳提取工藝條件組合為A1B1C2D2，即乙醇濃度為 70%，提取溫度 60 ℃，料液比為 1∶10（g/mL）和提取時(shí)間為30 min。

2.3 最佳工藝條件驗(yàn)證

根據(jù)所篩選的最佳工藝條件提取蕎麥葉大百合3份，按照“1.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮的提取率，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Verify the experimental results

結(jié)果表明：總黃酮提取率為10.90 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.27%，總黃酮提取率較高，重現(xiàn)性較好，表明此提取工藝穩(wěn)定合理。

2.4 DPPH自由基清除作用的測(cè)定

不同濃度的蕎麥葉大百合的總黃酮溶液、對(duì)照品VC溶液對(duì)DPPH 自由基清除率結(jié)果見圖6。

圖5 不同濃度的蕎麥葉大百合總黃酮和抗壞血酸對(duì)DPPH 自由基的清除率Fig.5 DPPH radicals scavenging activities of VCand total flavonoids

在濃度0～24 μg/mL 范圍內(nèi)其清除能力隨總黃酮濃度的升高而加強(qiáng)，當(dāng)濃度增加為32 μg/mL，清除率達(dá)到95.72%，此后其清除率基本趨于平衡。根據(jù)SPSS20.0軟件數(shù)據(jù)分析，得到蕎麥葉大百合總黃酮EC50為4.439 μg/mL 和 VC的 EC50為 18.746 μg/mL，可見，蕎麥葉大百合總黃酮對(duì)DPPH 自由基清除率明顯高于VC。

3 結(jié)論與討論

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)龍牙百合花、香水百合中總黃酮提取工藝及抗氧化性有研究[2-6]，但蕎麥葉大百合黃酮提取工藝及抗氧化性尚未出現(xiàn)報(bào)道，此外由于黃酮類化合物不溶于水，易溶于乙醇等有機(jī)溶劑，因此本試驗(yàn)初步采用乙醇回流法提取蕎麥葉大百合中總黃酮，用醇溶液進(jìn)行提取時(shí)，脂溶性物質(zhì)如黃酮類可被大量溶出，因此以總黃酮提取率為指標(biāo)確定最佳提取工藝，優(yōu)化后得到的最佳提取工藝參數(shù)：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70 %，液料比為 1∶10（g/mL），回流提取時(shí)間為 30 min，提取溫度為60 ℃，在此工藝條件下進(jìn)行回流提取，得到蕎麥葉大百合總黃酮的平均提取率為10.90 mg/g，此提取工藝重現(xiàn)性良好。此結(jié)果為進(jìn)一步研究蕎麥葉大百合總黃酮適合于工業(yè)化生產(chǎn)的最佳提取工藝打下良好基礎(chǔ)。

體外抗氧化初步研究表明，蕎麥葉大百合中總黃酮對(duì)于DPPH 自由基的清除能力顯著優(yōu)于抗氧化劑VC，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，為其在食品、藥品等領(lǐng)域開發(fā)天然抗氧化劑提供一定的理論依據(jù)。