海藻酸鈉/冬凌草提取物復(fù)合膜的制備和應(yīng)用

糾敏，孟媛媛，李桂霞，齊龍升，鐘強(qiáng)，汪倫記，2，*

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院食品加工與安全國家級實驗教學(xué)示范中心，河南洛陽471023；2.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實驗室，河南洛陽471023）

我國是世界上果蔬生產(chǎn)大國，也是消費(fèi)大國。但果蔬生長的季節(jié)性強(qiáng)，新鮮果蔬水分含量多，采后生理活動旺盛，易破損腐爛，因此，給果蔬的采后處理、貯藏保鮮造成困難。由于貯藏不善，或生理與微生物病害的影響，往往導(dǎo)致大量果蔬的腐爛損失。在眾多影響新鮮果蔬品質(zhì)的因素中，采后病害引起的腐爛是導(dǎo)致貯藏?fù)p失最重要的原因。目前，已發(fā)展出多種的果蔬貯藏保鮮技術(shù)，如冷藏保鮮[1-2]、氣調(diào)貯藏[3]、化學(xué)方法保鮮[4-5]、涂膜保鮮[6-8]等。但目前生產(chǎn)實踐中仍然主要依靠化學(xué)殺菌劑。殺菌劑的長期和大量使用，嚴(yán)重污染環(huán)境，有害于人類健康。因此，開發(fā)綠色、安全、高效的果蔬貯藏技術(shù)已迫在眉睫。

草本植物提取物，具有低毒高效、且殘留少、環(huán)境友好、選擇性強(qiáng)、病原菌難以產(chǎn)生抗藥性。在可食用膜中添加草本植物提取物用于果蔬保鮮，具有明顯的防腐效果，已成為開發(fā)新型涂膜保鮮劑的一個重要發(fā)展方向[9-10]。我國有豐富的中草藥資源，許多中草藥如大黃、黃連、五倍子等有廣泛的殺菌抑菌性，對果蔬采后病菌有較好的抑制作用。目前，已有丁香、大黃、五倍子、高良姜、肉桂等提取液與其他保鮮物質(zhì)間的復(fù)配物涂膜用于蘋果、番荔枝、枇杷、梨等果實的貯藏保鮮，并取得良好效果的報道[11-14]。

冬凌草是我國的特色中草藥，1972年從民間被發(fā)掘出來，其主要活性成分為冬凌草甲素[15]。冬凌草甲素為貝殼杉烯骨架的四環(huán)二萜類化合物，無色棱柱狀結(jié)晶，味道極苦，不溶于水，溶于乙醚、甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，具有抗炎、抗菌、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理活性[16]。據(jù)研究，冬凌草對番茄灰霉病菌和蘋果炭疽病菌等植物病原菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)具有一定的抑制作用[17]。但是，目前有關(guān)冬凌草用于果蔬保鮮的研究鮮有報道。本文以海藻酸鈉為成膜劑，冬凌草提取物作為抑菌劑，甘油為增塑劑，氯化鈣作為交聯(lián)劑，對海藻酸鈉/冬凌草提取物復(fù)合膜的物理特性進(jìn)行了分析，并考察了其對砂糖橘的保鮮效果，以期為冬凌草應(yīng)用于果蔬的防腐保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

冬凌草地上部分，采自河南省濟(jì)源市，由河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院原江鋒副教授鑒定，干燥后經(jīng)中藥粉碎機(jī)粉碎，過60 目篩放入干燥器中備用；砂糖橘：市售，挑選大小、色澤均勻、無病、蟲、傷的果實。

2，6-二氯酚靛酚、海藻酸鈉、抗壞血酸、葡萄糖、氯化鋇、草酸、蒽酮、無水乙醇、甲醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甘油、氯化鈉等均為分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

BSA224S 電子天平：德國 Sartorius；UV752 紫外可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-5298旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；H-2050R 低溫超速離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；LDZX-30KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；中藥粉碎機(jī)：北京科偉永興儀器有限公司；DHG-9246A 電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；LRH-250F 生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2D 超凈工作臺：上海蘇凈實業(yè)有限公司；螺距測微計：德國（masterproof）麥思德；Instron5544 型質(zhì)構(gòu)儀：美國Instron 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 冬凌草醇提物的制備

稱取制備的冬凌草30 g，放入回流裝置的提取瓶中，加入95%的乙醇300 mL，把回流裝置放入超聲波發(fā)生器中進(jìn)行超聲乙醇回流提取，提取溫度40 ℃、每次提取時間30 min、超聲功率150 W，提取2 次，合并兩次濾液，減壓抽濾，濾液經(jīng)45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮制得浸膏，浸膏經(jīng)真空干燥制成固體粉末。

1.2.2 海藻酸鈉/冬凌草醇提物復(fù)合膜制備

稱取2 g 海藻酸鈉溶解于80 ℃100mL蒸餾水溶液中，充分?jǐn)嚢柚寥芤撼吻濉＠鋮s至25 ℃左右，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.125%、0.25%、0.5%、1%和2%的冬凌草醇提物，接著加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的甘油，在磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢枞芙猓o止過夜脫氣。然后取10 mL加入18 cm×10 cm 的干凈玻璃板上流延成膜，放入40 ℃的烘箱中烘干，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2 %的氯化鈣交聯(lián)2 min，用蒸餾水沖洗干凈，揭膜晾干，25 ℃下平衡24 h 備用。

1.2.3 海藻酸鈉/冬凌草醇提物復(fù)合膜的物理特性分析

1.2.3.1 復(fù)合膜厚度測定

使用精確度為0.001 mm 的螺旋測微計在膜的中心及四角測厚度，求平均數(shù)，單位mm。

1.2.3.2 復(fù)合膜機(jī)械性能測定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[18]分別測定膜的抗拉伸強(qiáng)度（MPa）和斷裂延伸率（%）。對每個處理的樣品做3 平行。抗拉伸強(qiáng)度和斷裂延伸率的公式分為式（1）和式（2）所示：

式中：ST 為抗拉伸強(qiáng)度，MPa；Fm 為膜斷裂時承受最大拉力，N；L 為膜的厚度，m；W 為膜的寬度，m。

式中：TS 為斷裂延伸率，%；Lmax為膜斷裂時達(dá)到最大長度，m；L0為膜的初始長度，m。

1.2.3.3 透光率測定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[19]測量復(fù)合膜透光率。每個處理重復(fù)3 次。復(fù)合膜的透光率公式為：

式中：Tr 是薄膜在560 nm 下的透過率；T0是空白對照，為不放薄膜時比色皿的透過率（其透過率為100%）。

1.2.3.4 水蒸汽透過率的測定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[20]測定復(fù)合膜的水蒸汽透過率（water vapor permeability，WVP），WVP 計算公式為：

式中：X 為膜的平均厚度，mm；S 為有效面積 1.8×10-3m2；Δm 為兩次質(zhì)量之差，g；t 為間隔時間，h；ΔP 為膜兩側(cè)的蒸汽壓差，由于膜兩側(cè)環(huán)境濕度梯度為100%，ΔP=3.2 kPa（22 ℃）。

1.2.4 海藻酸鈉/冬凌草提取物復(fù)合膜對砂糖橘保鮮效果的研究

試驗分為3 組，即未經(jīng)涂膜處理的對照組（CK）、海藻酸鈉涂膜組和冬凌草-海藻酸鈉保鮮劑涂膜組。制備的涂膜溶液對砂糖橘浸泡3 min 涂膜，自然風(fēng)干。用0.004 mm 帶孔的聚乙烯包裝，橡皮筋封緊袋口并標(biāo)上記號，25 ℃左右貯藏。每組3 個平行，每個平行10 個砂糖橘[21]。

1.2.4.1 貯藏效果測定

失重率：采用稱重法。

1.2.4.2 果實品質(zhì)分析

從每個處理中隨機(jī)抽取10 個果實，經(jīng)搗碎機(jī)破碎，低溫離心，取上清液進(jìn)行果實品質(zhì)分析。采用數(shù)顯折光儀測定可溶性固形物含量，酸堿滴定法測定可滴定酸度，蒽酮比色法測定總糖含量，2，6-二氯酚靛酚滴定法測定抗壞血酸的含量[22]；每次平行測定10 次，取平均值。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 冬凌草提取物對復(fù)合膜厚度、透光率和水蒸氣透過率的影響

海藻酸鈉是一種從海帶或藻類植物中提取的天然多糖，具有優(yōu)良的成膜性、透氣性、保濕性、生物降解性和生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，在果蔬的保鮮中常用作成膜基質(zhì)材料[23]。由于具有親水性基團(tuán)，其阻濕性較差，冬凌草醇提物對復(fù)合膜厚度、透光率和水蒸氣透過率的影響見表1。

表1 冬凌草醇提物對復(fù)合膜厚度、透光率和水蒸氣透過率的影響Table 1 Effect of R.rubescens extract on thickness，transparency and water vapor permeability of film

從表1 可以看出，添加不同質(zhì)量濃度的疏水性較強(qiáng)的冬凌草提取物，能顯著降低復(fù)合膜的水蒸氣透過率（P＜0.05）。應(yīng)用于果蔬保鮮時，能通過降低果蔬氣體交換，減小水分蒸騰，保持其飽滿的外表與硬度。但隨著冬凌草提取物添加量增加，復(fù)合膜的厚度逐漸增加，透光率顯著下降（P＜0.05）。膜厚度的增加會導(dǎo)致膜的脆性增加，給應(yīng)用帶來困難，同時也會導(dǎo)致膜制備的成本的增加。復(fù)合膜透光率的下降是由于冬凌草提取物呈現(xiàn)深綠色的緣故。

2.2 冬凌草提取物對復(fù)合膜機(jī)械特性的影響

拉伸強(qiáng)度和延展性是評價包裝材料機(jī)械性能的重要指標(biāo)[18]。海藻酸鈉透濕性強(qiáng)，溶液具有一定黏度，具有良好的成膜性，形成的膜也具有良好的拉伸性能。冬凌草提取物對復(fù)合膜機(jī)械性能的影響見表2。

表2 冬凌草醇提物對復(fù)合膜機(jī)械性能的影響Table 2 Effect of R.rubescens extract on mechanical properties of film

由表2 可知，添加冬凌草提取物改變了復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率。隨著冬凌草提取物添加量的增加，復(fù)合膜的抗拉伸強(qiáng)度增大，這可能是由于冬凌草提取物的加入，通過分子間的相互作用，有利于海藻酸鈉的規(guī)整排列，并使結(jié)晶發(fā)生了變化，但隨著冬凌草添加量繼續(xù)增加，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.5%時，復(fù)合膜拉伸強(qiáng)度呈下降趨勢，這可能由于冬凌草提取物的添加量繼續(xù)增加使得水分不能和增塑劑形成氫鍵，導(dǎo)致復(fù)合膜的含水量少故容易出現(xiàn)斷裂，近而喪失應(yīng)有的彈性，使得復(fù)合膜的抗拉伸強(qiáng)度下降。隨著冬凌草提取物添加量的增加，復(fù)合膜的斷裂拉伸率有所降低。這是由于冬凌草添加量的增加，海藻酸鈉分子在成膜過程中的定向排列穩(wěn)定性變強(qiáng)，最終形成的復(fù)合膜結(jié)構(gòu)比較有序，且致密性高，剛性強(qiáng)。

王大海等[17]報道冬凌草中抑菌活性成分對灰霉病菌和炭疽病菌等的菌絲生長和孢子萌發(fā)具有一定的抑制活性，其EC50值在668 mg/L～3 869 mg/L 之間。因此，復(fù)合膜應(yīng)用于水果保鮮時，冬凌草提取物添加量少，導(dǎo)致抑菌活性成分不能有效抑制霉菌對砂糖橘的侵染；添加量過多，復(fù)合膜較厚，拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率降低，會導(dǎo)致應(yīng)用困難。綜合考慮復(fù)合膜的抑菌活性、阻濕性和機(jī)械性能，選擇添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的冬凌草提取物制備的復(fù)合膜進(jìn)行砂糖橘的保鮮試驗。

2.3 海藻酸鈉-冬凌草醇提物復(fù)合膜對砂糖橘貯藏效果的影響

水分是果實的主要成分，是衡量果實新鮮度、味道等一項重要指標(biāo)。在果實貯藏期間，呼吸作用消耗果實體內(nèi)的水分和蒸騰作用使果實水分減少，失重率不斷的增加，影響水果的貯藏，縮短其貯藏時間[24]。海藻酸鈉-冬凌草醇提物復(fù)合膜對砂糖橘貯藏效果的試驗結(jié)果見圖1。

圖1 海藻酸鈉-冬凌草醇提物復(fù)合膜對砂糖橘貯藏效果的影響Fig.1 Effect of alginate coating enriched with R.rubescens extract on storage of shatang mandarin

由圖1 可知，常溫貯藏時各組砂糖橘失重率逐漸增加。其中，空白對照組的砂糖橘失重率明顯高于其他處理組，貯藏至第40 天時失重率已達(dá)到6.8%。而冬凌草提取物復(fù)合涂膜組失重率一直處于較低的水平，到第40 天時，失水率為5.87%，保水效果最好（P＜0.05）。

冬凌草提取物-海藻酸鈉復(fù)合膜對砂糖橘好果率的試驗見圖1。從圖1 可知，各組的好果率均呈現(xiàn)下降趨勢。其中，空白對照組在第10 天已出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象，貯藏至20 d 時，涂膜組砂糖橘均出現(xiàn)腐爛情況。貯藏至40 d 時，空白對照組的好果率已下降至62%，冬凌草提取物/海藻酸鈉復(fù)合涂膜組的好果率為88%，顯著高于對照組。試驗結(jié)果表明冬凌草提取物/海藻酸鈉復(fù)合涂膜能更好地保持果實的質(zhì)量，提高果實的好果率，延長果實的貨架期。

2.4 海藻酸鈉/冬凌草醇提物復(fù)合膜對砂糖橘貯藏品質(zhì)的影響

VC對維持生物體正常的生理功能有重要作用，是人體必需的營養(yǎng)素，也是水果中含量較高的營養(yǎng)成分之一，水果的貯藏品質(zhì)和維生素C 的含量有密切關(guān)系。海藻酸鈉-冬凌草醇提物復(fù)合膜對砂糖橘貯藏品質(zhì)的影響見圖2，海藻酸鈉-冬凌草醇提物復(fù)合膜對砂糖橘維生素C 的含量影響見圖2a。

由圖2a 可以看出砂糖橘中VC含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，貯藏到40 d 時，空白對照組的VC含量為9.23 mg/100 g，而復(fù)合涂膜組砂糖橘VC含量和對照組相比存在顯著的差異，高達(dá)12.17 mg/100 g（P＜0.05）。

圖2 海藻酸鈉-冬凌草醇提物復(fù)合膜對砂糖橘貯藏品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of alginate coating enriched with R.rubescens extract on storage quality of shatang mandarin

可溶性固形物是蔬果中用來衡量其營養(yǎng)成分的一個重要指標(biāo)。海藻酸鈉-冬凌草醇提物復(fù)合膜對砂糖橘可溶性固含物的含量影響見圖2b。由圖2b 中可知，砂糖橘貯藏前期可溶性固形物會先增加，隨著果實漸漸成熟，可溶性固形物不再增加，還會作為呼吸強(qiáng)度的能量來源而不斷被消耗，貯藏后期可溶性固形物含量降低。在試驗中，復(fù)合涂膜處理的砂糖橘貯藏到40 d 時，可溶性固形物含量顯著高于對照組（P＜0.05），這表明，涂膜處理降低了砂糖橘的生理活性，延緩了果實的后熟過程。

糖是維持果實生理活性重要的能量，由圖2c 可知，砂糖橘中的總糖含量在貯藏過程中呈先上升再下降的變化，這是因為貯藏的砂糖橘，隨著貯藏時間的延長而逐漸成熟，果實中相關(guān)成分轉(zhuǎn)化為糖類，糖分逐漸積累到最高值，到后期由于呼吸作用的消耗，總糖含量開始下降。貯藏到40 d 時，復(fù)合涂膜組砂糖橘的總糖含量高于對照組（P＜0.05），試驗表明，冬凌草提取物和海藻酸鈉復(fù)合膜能有效的延緩糖分的消耗。

復(fù)合膜對砂糖橘可滴定酸含量的影響見圖2d，由圖2d 可知，不同處理組砂糖橘可滴定酸含量在貯藏過程中呈下降趨勢，這是由于果實貯藏期間合成酸的酶活性下降，呼吸作用導(dǎo)致有機(jī)酸降解為其他小分子物質(zhì)。復(fù)合涂膜組可滴定酸含量顯著高于對照組，能減少總酸的降解量，延緩貯藏時間。

3 結(jié)論

本文研究了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的冬凌草提取物對冬凌草提取物-海藻酸鈉復(fù)合膜物理特性的影響。結(jié)果表明冬凌草提取物顯著降低復(fù)合膜的透光率和水蒸氣透過率（P＜0.05）。在海藻酸鈉中加入冬凌草提取物能改善復(fù)合膜的阻濕性，但其質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.5%時，會降低復(fù)合膜的機(jī)械性能。對制備的海藻酸鈉-冬凌草提取物復(fù)合涂膜溶液對砂糖橘的保鮮試驗結(jié)果表明，復(fù)合膜抑制了果實的采后腐爛及水分損失，失重率顯著低于空白對照組（P＜0.05），同時延緩了可溶性固形物、可溶性糖的含量、可滴定酸及VC含量的下降，具有較好的保鮮效果。