加熱對雞卵類黏蛋白結構及其與IgG結合能力的影響

吳子健，張允萍，侯惠靜，李曉萌

（1.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134；2.天津天獅學院生物與食品工程學院，天津301700）

目前，全球對雞蛋產生過敏反應的致敏癥患者越來越多[1]。雞蛋不僅是人們的日常食品，而且還是重要的食品工業原料，這也導致了雞蛋致敏癥患者幾乎無法避免來自雞蛋致敏性的威脅。雞卵類黏蛋白（hen's egg ovomucoid，HOVM）是雞蛋卵清中一種致敏性廣泛、反應劇烈且后果嚴重的過敏原蛋白[2]，會使皮膚血管擴張引起風疹、皮疹，或使胃腸道平滑肌痙攣引起腹瀉、腹痛；或使支氣管平滑肌收縮導致喘鳴[3]。

HOVM 的含量約占雞蛋清蛋白總量的11%，是分子質量約為28 kDa 的單亞基糖蛋白，其包括蛋白部分（約75%～80%，由186 個氨基酸殘基組成）和糖基部分（約20%～25%）[4]。熱處理是食品加工中一種常用的食物處理方式，不僅能夠熟化食物，而且能增加食物的口感和風味以及保障食品的安全，研究熱處理對于雞蛋中HOVM 等過敏性蛋白的影響具有十分重要的意義[5]。本課題旨在研究熱處理對HOVM 的過敏原性和結構的影響，為探討HOVM 在熱處理作用下結構以及過敏原性的變化規律提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋：市售；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、雞卵類黏蛋白抗體NBP1-74676：美國Novus Biologicals 公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）：杭州華安生物技術有限公司；其它試劑均為國產分析純。

1.2 試驗儀器

3-18K 離心機：德國 Sigma 公司；EL204 電子天平、FE20 型pH 計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；IB8 eco 恒溫水浴鍋：德國IKA 公司；MOS-450/AF-CD圓二色譜儀：法國Biologic 公司、FL970 熒光分光光度計：上海天美科技有限公司；Spectra Max190 光吸收酶標儀：美國美谷分子儀器有限公司；2000ES 全自動四元梯度高效液相色譜儀（配套UV1000 紫外檢測儀）：美國科學公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 HOVM 的提取

HOVM 的提取過程參考王帥等[6]方法，具體過程為：將手工分離得到的雞蛋蛋清液加入等體積去離子水，置于4.0 ℃下磁力攪拌2 h，然后離心15 min（4 ℃，4 200 r/min），棄沉淀與不溶物，所得上清液緩緩加入等體積三氯乙酸溶液（pH 1.15，10%）并混合均勻，用1.0 mol/L NaOH 溶液調節pH 值至3.5，并于4.0 ℃下靜置4 h，離心 15 min（4 ℃，4 200 r/min），取上清置于 4 ℃下透析24 h 以便去除三氯乙酸，透析后的溶液加入硫酸銨至其濃度為50%（體積比），4 ℃下靜置4 h，離心15 min（4 ℃，4 200 r/min），取上清再次加入硫酸銨至其終濃度為80 %，再次于4 ℃下靜置4 h，最后離心15 min（4 ℃，4 200 r/min），取沉淀，并溶于 20.0mL去離子水中，透析12 h 后凍干，得到HOVM 純品。

1.3.2 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）

SDS-PAGE 電泳[7]條件：分離膠濃度為12%；濃縮膠濃度為5%；標準蛋白質Marker 采用Fermentas 公司的預染marker（貨號為SM0672）；電泳電壓為200 v；電泳時間40 min。

1.3.3 高效液相色譜

利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[8]檢測 HOVM 樣品的純度，色譜條件如下：色譜柱為 Vydac 214TP C4（5 μm，250 mm×4.6 mm）；柱溫為 30 ℃；檢測波長為 220 nm；流動 A 相為水相（含0.1%三氟乙酸）、流動B 相為乙腈（含0.1%三氟乙酸）；洗脫流速為0.3 mL/min。

1.3.4 HOVM 樣品的加熱處理

將HOVM 樣品溶于磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L、pH 7.4）中，等量分裝至試管中，進行加熱處理，溫度分別為 60、70、80、90、100 ℃，加熱時間分別為 30、50、70、90、110 min；加熱結束后立即置于冷水中冷卻。

1.3.5 圓二色譜法

HOVM 的二級結構表征采用圓二色譜法[9]。具體方法為：將HOVM 配置為0.2 mg/mL 的HOVM 溶液（10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 7.4）；圓二色譜掃描參數為：光徑1.0 cm、波長范圍190 nm～250 nm、帶寬1.0 nm、掃描速率為60 nm/min、每個樣品掃描3 次，取平均值。利用DichroWeb 在線分析程序分析蛋白二級結構組成。

1.3.6 表面疏水性和表面疏水指數S0的測定

HOVM 的表面疏水性采用熒光探針法進行測定[9]。具體方法為：取4.0mLHOVM 待測溶液（0.1 mg/mL），加入 20 μL ANS 熒光探針溶液（1.0 mmol/L），25 ℃條件下避光靜置1 h；掃描參數為：激發波長380 nm、發射波長400 nm～700 nm、狹縫寬度5 nm、掃描速度1 200 nm/min。表面疏水指數S0具體方法為：分別量取不同濃度的 4mLHOVM 待測溶液（0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL），加入 20 μL ANS 熒光探針溶液（1.0 mmol/L），25 ℃條件下避光靜置1 h；具體掃描參數如下：激發波長380 nm、發射波長418 nm、狹縫寬度5 nm、掃描速度1 200 nm/min。以蛋白質濃度對熒光強度作圖，采用最小二乘法進行曲線擬合，直線斜率即是蛋白質表面疏水指數S0。

1.3.7 間接酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法

HOVM 與IgG 的結合能力采用間接ELISA 法進行測定[10]，具體操作如下：將HOVM 溶于包被液中至蛋白質終濃度為0.02 mg/ml；將HOVM 待測溶液置于96 孔板中，每孔 100 μL 包被液（pH 9.6），4 ℃下包被過夜；然后將包被液傾出，并用磷酸鹽吐溫緩沖液（pH 7.4，磷酸鹽緩沖溶液+1%吐溫-20）洗滌3 次；向每孔中加入200 μL 封閉液[磷酸鹽吐溫緩沖液+1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）]于 37 ℃下水浴封閉2.5 h；再用磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3 次；向每孔中加入 100 μL 抗體稀釋溶液（體積比 1∶20000），37 ℃下孵育2 h；最后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體（體積比 1∶2 000）100 μL，37 ℃下孵育 1.5 h，最后加入底物顯色液（鄰苯二胺）100 μL，37 ℃下避光靜置 15 min，測定 OD492nm值。

1.3.8 數據處理與統計分析

用Origin 8.0 作圖，用SPSS 17.0 軟件對試驗數據進行相關性分析，采用 dichroweb（http：//dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml）在線分析圓二色光譜的變化。

2 結果與討論

2.1 HOVM蛋白樣品的分離效果

經過方法1.3.1（即三步沉淀法），所得樣品的高效液相色譜以及SDS-PAGE 電泳結果如圖1 所示。

圖1 HOVM 樣品純度的檢測Fig.1 HOVM sample purity evaluation

結果顯示：對比HOVM 樣品和標準品液相色譜圖，樣品與HOVM 標準品均在約7.0 min 時開始出峰，8.0 min 時會達到最大峰值，可以判斷所提樣品為HOVM；另外經CSChrom Plus 軟件峰面積計算可知提取樣品的純度可達99.688%，略高于標準品蛋白質的純度（99.016%），該結果與王帥[10]、史曉霞[11]所得結果基本一致。HOVM 樣品的SDS-PAGE 電泳圖譜（如圖1a 所示）結果顯示樣品蛋白電泳道呈現較粗的條帶，大約位于20 kDa～39 kDa 分子量范圍內，此結果也與王帥、史曉霞等所得到的結果相同，這是因為HOVM中的糖基含量較高（為20%～25%），而糖基含量較高導致其SDS-PAGE 電泳圖中呈現出較粗的條帶[12-13]。

2.2 熱處理對卵類黏蛋白與IgG結合能力的影響

熱處理對卵類黏蛋白與IgG 結合能力的影響如圖2 所示。

圖2 熱處理對HOVM 與IgG 結合能力的影響Fig.2 Effects of heating treatment on HOVM's ability to bind IgG

OD492nm值是用于表征間接ELISA 法檢測HOVM分子與IgG 的結合能力，OD 值越大，則說明HOVM 與IgG 結合能力越強；反之，OD 值越小，則表明HOVM與IgG 結合能力越弱。溫度對HOVM 與IgG 的結合能力的影響如圖2 所示：熱處理的強度（包括溫度和時間）的提高會降低HOVM 與IgG 結合能力。其中在加熱溫度為 60、70、80 ℃時，OD492nm值下降較緩慢，這也印證了卵類黏蛋白具有高耐熱特性；當加熱溫度達到90 ℃和 100 ℃時，OD492nm值明顯減小，HOVM 與 IgG 的結合能力下降：當加熱時間低于70 min 時，OD492nm值逐漸減小，HOVM 與IgG 的結合能力逐步下降，當熱處理時間提升到90、110 min 時，OD492nm值趨于平穩達到最低值，HOVM 與IgG 的結合能力下降至最低值。這些研究結果與史曉霞[11]的研究結果類似。加熱處理對于其它雞卵清中的過敏蛋白結合IgG 的影響也有報道，如Tong P 等[14]的研究發現：熱處理卵轉鐵蛋白，處理時間5 min～45 min 內，當加熱溫度不超過60 ℃時，卵轉鐵蛋白與IgG 的結合能力較強，且隨著時間增加結合能力略有提升；當加熱溫度達到70 ℃，加熱5 min 時，卵轉鐵蛋白與IgG 的結合能力最大，當熱處理時間超過5 min 后，卵轉鐵蛋白與IgG 的結合能力迅速降低；當加熱溫度超過70 ℃后，隨著熱處理的時間的延長，卵轉鐵蛋白與IgG 的結合能力逐步降低，并在30 min以后趨于平緩達到最低值。說明熱處理程度的提高（包括溫度的升高和加熱時間的延長），可以降低這些過敏性蛋白結合IgG 的能力。

2.3 加熱對HOVM表面疏水性的影響

加熱對HOVM 表面疏水性的影響如圖3 所示。

蛋白質的表面疏水性可反映蛋白質分子表面存在的疏水基團數量的變化，也可間接顯示蛋白質三級結構的變化情況，是衡量蛋白質功能性質的關鍵指標之一[15]。通常蛋白質折疊過程中，大多非極性氨基酸殘基會由于疏水相互作用從而聚集形成蛋白質的疏水性內核，成為維持蛋白質三級結構的重要作用力[16]；但有時，由于某些原因（如變性、溶解環境的變化等），蛋白質分子中的疏水性氨基酸殘基會部分暴露在外表面，通常會借助可發熒光的疏水性探針（如ANS）與蛋白質表面暴露的疏水性殘基相互結合，利用所產生熒光強度的變化來間接反映蛋白質的表面疏水性強度[17-19]。本研究利用ANS 熒光探針法檢測HOVM 分子表面疏水性，熱處理溫度和時間對HOVM 分子表面疏水性產生的影響如圖3 所示：熱處理時間相同的條件下，加熱溫度對HOVM 表面疏水性影響的變化趨勢基本一致；當處理溫度范圍為60 ℃～90 ℃時，HOVM 的外源性熒光強度隨著溫度的升高而增強（即HOVM 的表面疏水性隨處理溫度升高而增加），表明60 ℃～90 ℃溫度范圍內，加熱會逐漸增加蛋白質分子中疏水性氨基酸殘基的暴露程度，進而使得其外源性熒光強度增強；但當加熱溫度為100 ℃時，HOVM 的外源性熒光強度會下降，只比處理溫度60 ℃下的熒光強度高一點，可能的原因在于溫度升高到一定程度時，蛋白質分子之間會發生不可逆的聚集，形成大的蛋白質分子聚集體，從而會掩蔽一部分原本暴露的表面疏水性基團，也就減少了與ANS 結合的疏水性殘基的數量，此時的熒光強度就會顯著降低[20]；另外，在一些物理過程（如加熱等）的作用下，蛋白質分子與ANS 熒光探針結合后，其最大熒光波長會發生藍移[21]。從圖3 中可以看出，隨著處理強度（包括時間和溫度）的提高，HOVM 的最大熒光波長數（λmax）較之對照組會發生藍移。相同加熱時間下，隨著熱處理溫度的升高，HOVM 的藍移程度不斷加大。且在每組數據中都發現，加熱溫度達到90 ℃和100 ℃時，藍移程度最大。如加熱時間30 min 時，60、70、80、90 ℃以及 100 ℃處理溫度下，λmax藍移分別為25、20、23、28 nm 的藍移。

圖3 熱處理對HOVM 表面疏水性的影響Fig.3 Effects of heat treatment on HOVM's surface hydrophobicity

熱處理對IgG 結合能力與表面疏水性指數S0的影響如圖4 所示。

圖4 熱處理對IgG 結合能力與表面疏水性指數S0的影響Fig.4 Effects of heat treatment on HOVM's IgG-binding ability and surface hydrophobicity index S0

如圖4 所示，熱處理溫度為 60、70、80 ℃且熱處理時間不超過70 min 時，表面疏水性指數隨著熱處理時間的延長而增大，并在70 min 時有最大值，這可能是因為在加熱時蛋白質分子就從天然的卷曲狀態發生變性而舒展開，原來藏在卷曲結構內部的一些疏水基團就暴露出來，而在外部的親水性基團相對減少，結果導致S0的增大。當熱處理溫度為80 ℃時，熱處理時間在 70 min～110 min 時，OD492nm值有一個先下降再上升的過程，而對比表面疏水性指數S0的變化，發現S0值較高，這可能是因為抗原表位多存在于親水區域[22]，表面疏水性指數的升高表明親水區域被掩蔽，即部分抗原表位被掩蔽，因此OD492nm值下降，即HOVM 與IgG 結合能力降低。當熱處理溫度為90、100 ℃時，發現表面疏水性指數與OD492nm值隨著加熱時間的延長呈現了一個自峰值下降的現象。這可能是因為當溫度過高時蛋白質發生了劇烈的凝聚致使其表面疏水性指數也隨之下降，這也使得其抗原表位失活，引起OD492nm值的顯著下降，即與IgG 結合能力下降。

2.5 加熱對HOVM二級結構的影響

加熱對HOVM 二級結構的影響如圖5 所示。

圖5 熱處理對HOVM 圓二色光譜圖譜及二級結構的影響Fig.5 Effects of Heating on the far-UV CD spectrum structure of HOVM.

圓二色譜法可用于分析蛋白質二級結構的變化，通常波長范圍在190 nm～250 nm，α-螺旋的特征峰為208 nm～222 nm 處的負肩峰和 192 nm 處的正峰；β-折疊的特征峰為214 nm 附近的負峰和185 nm～200 nm處的正峰；β-轉角的特征正峰在206 nm 處[23]。通過圓二色譜法檢測溫度對HOVM 二級結構的影響，其結果如圖5 所示：不同溫度下，經熱處理的HOVM 樣品圓二色譜圖均在206 nm 處附近有一正峰，且加熱時間延長，峰值會隨之提高，表明β-折疊的含量在逐漸提高且光譜曲線變得更加不平滑；當加熱溫度相同時，熱處理時間的延長會使200 nm～225 nm 處的負肩峰強度逐漸減小；熱處理110 min 時的HOVM 樣品圓二色譜圖譜中208 nm～225 nm 處的肩峰值強度最小，推測此時的α-螺旋含量最小。

由圖5，代表α-螺旋的負肩峰的峰強度隨著熱處理程度的增加而不斷減小，這表明熱處理使α-螺旋結構含量降低。代表β-折疊在214 nm 處顯示的特征負峰強度和代表β-折疊在185 nm～200 nm 處的正峰隨著熱處理程度的增加而不斷減小，這表明熱處理使β-折疊結構含量不斷降低，二級結構隨著熱處理時間的延長都呈現出α-螺旋和β-折疊的含量逐漸降低、而β-轉角和無規則卷曲的含量逐漸升高的趨勢。

2.4 加熱處理HOVM蛋白IgG結合能力與二級結構的變化的關系

加熱處理HOVM 蛋白IgG 結合能力與二級結構的變化的影響如圖6 所示。

蛋白質分子中多肽鏈平面通過氨基酸α-C 原子盤旋呈緊密而穩定的結構在加熱作用下轉變成為不規則的疏松構象，從而不同程度地影響蛋白質的二級結構[24]。

圖6 熱處理對IgG 結合能力與二級結構含量的影響Fig.6 The effect of heat treatment on IgG binding capacity and secondary structure content

由圖6 可知，在加熱的過程中，HOVM 的二級結構有明顯的改變，α-螺旋和β-折疊的含量均呈下降趨勢，β-轉角和無規則卷曲呈上升趨勢，無規則卷曲的含量在熱處理溫度100 ℃、熱處理時間110 min 時達到最大，占比為42.5%，β-轉角的含量雖然在逐步上升；但在加熱110 min，90 ℃下達到最高值，占比為23.5%，當加熱溫度提高至100 ℃時，β-轉角的含量略有下降。對比OD492nm值的變化，發現當加熱溫度超過80 ℃時，隨著時間的增加，可以看到α-螺旋、β-折疊的含量與OD492nm值的變化同趨勢下降。可以猜測抗原表位周圍含有較多的α-螺旋和β-折疊結構。在加熱溫度為 60、70 ℃的時候，α-螺旋、β-折疊的含量發生了下降但OD492nm值的變化并不明顯。這可能是因為蛋白質的二級結構發生了一定改變，但還不足以使其抗原表位被掩蔽掉，因此OD492nm值的變化不夠顯著，此時的HOVM 與IgG 的結合能力沒有過多的降低。

由于在加熱80 ℃以后OD492nm值有一個斷崖式的下降，因此選擇分段的方式進行相關性分析具體結果如表1，結果發現：當加熱溫度在60 ℃～80 ℃時，溫度、α-螺旋、β-折疊和β-轉角的含量均與OD492nm值均呈顯著相關，其中α-螺旋、β-折疊的含量與OD492nm值呈顯著正相關（p＜0.05），溫度、β-轉角的含量與 OD 呈顯著負相關（p＜0.01）。當加熱時間達到80 ℃以上時，時間、α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲的含量均與OD492nm呈顯著相關（p＜0.01），其中 α-螺旋、β-折疊的含量與 OD492nm值呈顯著正相關（p＜0.01），時間、β-轉角和無規則卷曲的含量與OD492nm值呈顯著負相關（p＜0.01）。

表1 二級結構與OD492nm值相關性分析匯總表Table 1 Summary of correlation analysis between secondary structure and OD492nmvalue

在進行進一步的偏相關性分析中發現：剔除加熱時間對其他因素的影響后，當加熱溫度在60 ℃～80 ℃時，溫度和β-轉角的含量均與OD492nm值在0.01 水平上呈顯著相關且均呈顯著負相關（p＜0.01）。當加熱時間達到90 ℃以后時，α-螺旋和無規則卷曲的含量均與OD492nm值呈顯著相關，其中α-螺旋的含量與OD492nm值呈顯著正相關（p＜0.01），無規則卷曲的含量與OD492nm呈顯著負相關（p＜0.05）。

當溫度達到80 ℃以上時，剔除加熱溫度對其他因素的影響后，發現加熱時間、α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲的含量均與OD492nm值均顯著相關。其中，α-螺旋、β-折疊的含量與OD492nm值呈顯著正相關（p＜0.01），時間、β-轉角和無規則卷曲的含量與OD492nm值呈顯著負相關（p＜0.01）。

3 結論

熱處理會影響HOVM 的結構及其與IgG 結合能力。首先，隨著熱處理強度（包括溫度和時間）的增加，HOVM 與IgG 的結合能力會不斷下降，特別是90 ℃和100 ℃處理下，HOVM 與IgG 的結合能力顯著下降達到最低值，相關性分析顯示60 ℃～80 ℃，溫度與OD492nm值呈顯著負相關（p＜0.01），而加熱溫度80 ℃以上時，加熱時間與 OD492nm值呈顯著負相關（p＜0.01）；其次，表面疏水性指數在熱處理強度不高的情況下會隨熱處理強度的提高而增加，熱處理強度高的情況下會隨強度的增高而下降，HOVM 的最大熒光波長數（λmax）發生藍移以及數值的變化表明HOVM 結構先變得松散，隨后處理溫度的攀升可能會進一步導致HOVM 蛋白發生凝聚；并且，在熱處理過程中，HOVM 的二級結構組成中α-螺旋和β-折疊的含量呈下降趨勢，β-轉角和無規則卷曲的含量呈上升趨勢；HOVM 二級結構組成的改變與其結合IgG 的能力之間存在一定關系，即當熱處理溫度在 60 ℃～80 ℃時，α-螺旋、β-折疊的含量與 OD492nm值呈顯著正相關（p＜0.05），β-轉角的含量與OD492nm值呈顯著負相關（p＜0.01）。當加熱時間達到80 ℃以上時，α-螺旋、β-折疊的含量與 OD492nm值呈顯著正相關（p＜0.01），β-轉角和無規則卷曲的含量與OD492nm值呈顯著負相關（p＜0.01）。