卵細胞體外成熟(IVM)在小鼠生物凈化中的應用*

杜江濤 武曉靜 戴方偉 盧領群 周莎桑 應華忠 郭紅剛

(1.浙江省醫學科學院浙江省實驗動物中心，杭州 310013)(2.杭州市中醫院，杭州 310007)

隨著生命科學和醫學研究的不斷深入，越來越多的轉基因小鼠應用到科學研究中。而在轉基因小鼠制備、飼養、運輸及品系共享等過程中，極易造成病原微生物的感染，生物凈化是目前去除病原微生物感染的有效途徑[1]。

生物凈化主要有剖宮取胎和體外受精-胚胎移植兩種方法。剖宮取胎操作相對簡單，但存在凈化不徹底和難以計算最佳剖宮時間等弊端；而體外受精-胚胎移植則需要掌握扎實的胚胎移植技術[2]。

體外受精-胚胎移植法在實際應用中需要大量的成熟卵子，但在超排過程中，由于小鼠年齡、品系、激素用量等許多因素的影響，常常會出現超排失敗或只有少量成熟卵子排出的現象，造成凈化失敗。這對于轉基因小鼠，特別是一些珍稀轉基因品系來說，是一種巨大的資源浪費。本文旨在利用卵母細胞體外成熟技術(invitromaturation,IVM)，深度挖掘未排卵小鼠卵巢內未成熟卵的發育潛力，以提高珍稀轉基因小鼠的卵子利用率，同時也作為常規促排卵失敗的一種補救措施。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

實體顯微鏡(LEICA,S8AP0)；二氧化碳培養箱(Thermo)；超凈工作臺(蘇州佳寶凈化工程設備有限公司)。

α-MEM基礎培養液(M4526，Sigma)；胎牛血清(22011-8612，浙江天杭生物科技股份有限公司)；丙酮酸鈉(P4562，Sigma)；M2培養液(M1250，南京愛貝生物科技有限公司)；獲能液/體外受精液(MR-070-D，Millipore)；胚胎發育液(MR-121，Millipore)；PMSG(160926)和HCG(160820)均購自寧波第二激素廠。

1.2 實驗動物

待凈化轉基因小鼠，雌鼠4～6周齡，雄鼠8周齡，來源于科研用小鼠。

清潔級ICR小鼠，雌鼠4～6周齡，雄鼠6～8周齡。來源于上海斯萊克實驗動物公司，使用許可證號：SCXK(滬)2017-0005。

以上動物均飼養于浙江省醫學科學院實驗動物中心屏障系統隔離包內，動物飼養合格證號：SYXK(浙)2014-0008。自由采食飲水，光照12 h/d(7:00-19:00)。

1.3 結扎公鼠的制備

6～8周齡ICR雄鼠，1%戊巴比妥鈉麻醉后切開下腹部皮膚和肌肉，暴露兩側輸精管，無菌彎鑷在酒精燈火焰上燒燙后迅速將輸精管夾斷。將斷開的輸精管小心放置原位，撒上少許青霉素粉后縫合肌肉皮膚，1個月后使用。

1.4 小鼠超排

實驗分組：A組：注射PMSG和HCG后未排卵卵巢，取卵泡內未成熟卵體外培養；B組：只注射PMSG，48 h后取卵泡內未成熟卵體外培養；C組：注射PMSG和HCG后，輸卵管內取成熟卵(正常超排組)直接進行體外受精；D組：注射PMSG和HCG后未排卵卵巢，取卵泡內裸卵和疑似成熟卵體外培養。下文均簡稱A組、B組、C組和D組。

下午5點，小鼠4周齡5 IU/只，5～6周齡7.5 IU/只，腹腔注射PMSG，48 h后注射相同劑量HCG，16～18 h后收集成熟卵母細胞、未成熟卵母細胞、裸卵和疑似成熟卵。只注射PMSG組則在注射PMSG 46～48 h后取未成熟卵，體外成熟培養16～18 h后進行體外受精與體外胚胎培養(具體方法詳見1.6)。

1.5 培養基準備

體外成熟培養液按參考文獻配制，主要成分為：α-MEM基礎培養液，5%胎牛血清(FBS)，3ng/mL EGF，50mIU/mL rhFSH，0.25 mmol/L丙酮酸鈉，青霉素與鏈霉素各0.5%[3]，0.2 μm濾膜過濾后分裝冷凍備用。

采卵前一天，用直徑35 mm培養皿分別做IVM液、獲能液/受精液、KSOM培養液等液滴，上覆石蠟油，37 ℃、5% CO2培養箱內過夜孵育。

1.6 精子獲能、體外受精與未成熟卵IVM

1.6.1精子獲能：采卵前1 h，頸椎脫臼處死雄鼠，在1∶200稀釋萬潔消毒液中浸泡消毒，置于干凈衛生紙上吸干液體。無菌手術器械取其兩側附睪尾，剔除多余脂肪組織，在無菌濾紙上來回滾動數次除去血漬，放入提前過夜孵育的獲能皿的石蠟油中。用無菌鑷夾住附睪尾使其繃緊，并用1 mL無菌注射器針頭刺破附睪尾，將溢出的精液移到獲能液滴中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中獲能1 h。

1.6.2體外受精：凈化用轉基因雌鼠，HCG注射16～18 h后，頸椎脫臼處死，1∶200稀釋萬潔消毒液中浸泡消毒，取其兩側卵巢和輸卵管，將其置于提前預熱至37 ℃的M2培養液中。M2培養液中再次清洗后，放在無菌濾紙上吸干液體，然后轉到提前過夜孵育的受精液滴皿的石蠟油中。靠近受精液滴，找到輸卵管膨大部，用1 mL無菌注射器劃破膨大部，將卵子移到受精液滴中。未見膨大部的卵巢則置于M2培養液中，37 ℃保溫備用。

取在培養箱中獲能1 h的獲能液滴皿，顯微鏡下檢查精子活力和精子數量。用移液器吸取獲能液滴周邊精子10 μL(約含精子200個/μL)，加入到已移入卵子的受精液滴中(50～100個)。37 ℃、5% CO2培養箱中受精4 h，然后將所有卵子轉至胚胎發育液KSOM中。

1.6.3未成熟卵IVM：取M2中保存的未超排卵巢，實體顯微鏡下用鑷子將卵巢周邊的脂肪及輸卵管剝離干凈，M2中清洗2～3次后，轉入事先37 ℃預熱的α-MEM中。用1 mL注射器針頭劃破卵泡，釋放卵丘卵母細胞復合體(COCs)。無菌玻璃管在酒精燈火焰上烤熱熔化后迅速拉至直徑比COCs稍粗的玻璃針(提前準備)，用口吸管吸取至少有3層顆粒細胞包裹的COCs，轉至另一皿干凈的α-MEM中。撿卵結束后將所有的COCs轉至事先在37 ℃、5% CO2培養箱過夜孵育的IVM液滴中，清洗2～3次后轉至200 μL大液滴，37 ℃、5% CO2培養箱內培養16～18 h，然后進行體外受精。精子獲能、體外受精方法同上。體外受精4 h后轉至胚胎發育液KSOM中。

取注射PMSG和HCG后未排卵卵巢卵泡內的裸卵和疑似成熟卵(卵丘顆粒細胞已擴散)，分為三組進行實驗：直接受精；體外成熟培養6 h后受精和體外成熟培養16～18 h后受精。受精4 h后轉至胚胎發育液KSOM中。

1.7 受體小鼠的挑選、合籠與胚胎移植

體外受精當天下午5點左右，挑取陰門紅腫發情的ICR雌鼠，與結扎雄鼠1∶1合籠交配。于次日早上挑取有陰栓的小鼠(即受體小鼠)，無菌環境下從隔離包轉至超凈工作臺。

受體小鼠1%戊巴比妥鈉麻醉，背部剃毛，75%酒精，碘酊再75%酒精消毒。在卵巢位置剪一縱向小口，依次剪開皮膚、肌肉、腹膜后，用鑷子找到脂肪墊，將其和卵巢、輸卵管一起拉出。用脂肪夾夾住脂肪墊，固定好卵巢和輸卵管，在顯微鏡下找到輸卵管膨大部并將其調整至最高位。玻璃針最前端吸取3個氣泡，然后吸取20～30個2-細胞胚，在輸卵管膨大部前端進針，將2-細胞胚吹至膨大部。當三個氣泡均吹至膨大部時，說明全部2-細胞胚已經移植到輸卵管膨大部內。

2 結果

2.1 A組和B組與C組卵細胞體外成熟率、二胞率、囊胚率及出生率

注射PMSG和HCG后，未排卵卵巢(A組)，取卵泡內未成熟卵體外培養，3次重復實驗，其成熟率為：88.6%(62/70)，83.3%(45/54)，89.2%(66/74)。二胞率為：67.1%(47/70)，42.6%(23/54)，55.4%(41/74)。13枚二細胞胚胎體外發育，有3枚發育至囊胚，囊胚發育率為23.1%(3/13)。將41枚二細胞胚胎移植到2只受體鼠體內，其中1只生出5只幼崽，產仔率為12.2%(5/41)。

只注射PMSG，48 h后取卵泡內未成熟卵(B組)，4次體外成熟培養，其成熟率為：79.3%(65/82)，88.1%(140/159)，82.4%(131/159)，86.0%(92/107)。二胞率為：59.8%(49/82)，44.0%(70/159)，43.4%(69/159)，59.8%(64/107)。囊胚率為：36.7(18/49)，58.6(41/70)，30.4(21/69)，28.1(18/64)。

注射PMSG和HCG后，輸卵管內取成熟卵(C組)，直接進行體外受精，受精后二胞率為：79.5%(167/210)，79.0%(233/295)，78.3%(195/249)。囊胚率為：73.7%(123/167)，79.8%(186/233)，80.5%(157/195)。見表1。

A組與B組相比，其成熟率和二胞率均無顯著性差異(P>0.05)。A組二胞率與C組相比，有顯著性差異(P<0.05)。B組二胞率與C組相比，有極顯著性差異(P<0.01)。A組和B組與C組相比，囊胚率均有極顯著性差異(P<0.01)。

表1 A組、B組和C組卵細胞體外發育結果Table 1 Oocytes in vitro development results of group A,B and C.

2.2 D組不同成熟培養時間卵細胞體外成熟率、二胞率及囊胚率

注射PMSG和HCG后未排卵的卵巢，取卵泡內裸卵和疑似成熟卵(D組)，體外成熟培養時間分為三組：成熟培養0 h(即直接進行體外受精)；成熟培養6 h和成熟培養16～18 h。受精后成熟培養0 h兩次重復實驗二胞率為10.2%、15.6%，囊胚率為0.0%、22.7%；成熟培養6 h二胞率為5.7%，囊胚率為0.0%；成熟培養16～18 h兩次重復實驗二胞率為1.3%、18.6%，囊胚率為0.0%、3.3%。(詳見表2)。

表2 D組卵細胞體外發育結果Table 2 Oocytes in vitro development results of group D

D組中體外成熟培養0 h、6h和16～18 h，其二胞率和囊胚率與組A、B、C相比均有極顯著性差異。

3 討論

3.1 超數排卵

通過超數排卵獲得大量整齊優質的卵子是生物凈化、轉基因、克隆等研究的基礎之一。影響超排的因素有很多，如：供體雌鼠的品系、年齡與體質量、激素的注射劑量和注射時間、環境因素(溫度、濕度和噪聲)等[4]。

我們在試驗中，對不同品系小鼠一律采用：3～4周腹腔注射5 IU PMSG和HCG；5～6周注射7.5 IU PMSG和HCG；而對7周及以上則注射10 IU PMSG和HCG，兩種激素注射間隔時間均為48 h。結果表明，C57BL/6 J小鼠超排效果最好且穩定。宋紹征等[5]研究發現在相同劑量激素條件下，ICR小鼠和C57BL/6 J小鼠的超排效果顯著優于BALB/c小鼠和FVB小鼠，我們試驗結果與其相一致，原因可能是近交系的遺傳因素導致BALB/c、FVB、129等小鼠的繁殖能力較差。

3～4周小鼠相較于其它周齡小鼠，可獲得最好的超排效果，這與徐平[6]的研究結果相一致，這可能是性成熟后的小鼠固有的性周期和性激素對外源性的超排激素(PMSG和HCG)有影響。

關于小鼠超排最合適的激素用量，目前國外多采用eCG/PMSG和HCG各5IU或各7.5IU劑量[3, 7-9]，國內有的采用PMSG和HCG各5IU或各10IU劑量。而我們在試驗過程中，則根據小鼠年齡體質量的不同做了適當調整。

年齡較大雌鼠和一些近交系小鼠(BALB/c、FVB、129等)的超排效果一直較差，甚至無排卵，正是這些問題的存在，迫使我們尋找一種新的方法來提高卵子利用率，卵母細胞體外成熟則為解決這一問題提供了新的途徑。

3.2 卵母細胞體外成熟

卵母細胞體外成熟(invitromaturation,IVM)是一項重要的輔助生殖技術和研究工具。因其可以生產成熟卵子被廣泛應用于各研究領域，如：人類不孕癥治療、家畜人工育種中的胚胎生產、克隆、干細胞和轉基因技術等[9]。

小鼠卵母細胞體外成熟一般是在注射eCG/PMSG 44或48 h后直接從卵泡中取未成熟卵體外培養[10-12]，而我們在生物凈化中則是針對注射PMSG和HCG后未排卵的卵巢。為了比較注射HCG對卵巢卵泡內未成熟卵體外發育的影響，我們設置了兩組試驗：注射PMSG和HCG后未排卵組(A組)和只注射PMSG，48 h后取未成熟卵組(B組)，同時以注射PMSG和HCG后正常超排卵組(C組)作為對照。結果發現：注射HCG對卵泡內未成熟卵體外成熟、體外受精、體外胚胎發育等并無影響，A組與B組的成熟率、二胞率均無顯著性差異(P>0.05)。因A組體外受精后大部分二細胞胚胎用于移植，只有很少一部分(13枚)用來做體外胚胎發育，所以A組與B組的囊胚率并無可比性。A組的二細胞胚胎做了3次移植試驗，分別移植34、23和41枚二細胞胚，但因受體等各種因素的影響，只成功了一次。41枚二細胞胚移植到兩只受體小鼠輸卵管內，其中一只成功受孕生出5只小鼠(2雄3雌)，5只小鼠性成熟后相互交配可產下正常的后代，說明通過IVM技術出生的小鼠是健康可育的[13]。

但是，注射HCG可導致超排后的卵巢質地松軟，卵巢表面缺少較好的卵泡，卵泡內部大部分為裸卵或卵丘顆粒細胞已經擴散的卵(疑似成熟卵)。與只注射PMSG相比，注射HCG后獲得的質量較好的卵丘卵母細胞復合物(COCs，至少有三層顆粒細胞包裹)大大減少。但是只要有顆粒細胞包裹的COCs，在體外成熟培養16～18 h后，顆粒細胞均會擴散，經體外受精后大部分可卵裂至二細胞胚胎，其成熟率和受精率均較理想。

A組、B組與正常超排卵對照組(C組)相比，卵細胞成熟率、二胞率和囊胚率均有顯著性差異，說明在現有的技術條件下，卵細胞體外成熟仍不能完全模擬其體內發育環境和條件，對卵細胞成熟的機理有待進一步研究。

PMSG和HCG注射后未排卵卵巢，卵泡內有大量裸卵和疑似成熟卵(卵丘顆粒細胞已擴散卵)，為了進一步挖掘這部分卵子的利用價值，我們分三組進行試驗：體外成熟培養0 h(直接進行體外受精)、體外成熟培養6 h后體外受精和體外成熟培養16～18 h后體外受精。直接進行體外受精組，兩次重復實驗，受精后二胞率分別為15.6%(22/141)和10.2(5/49)，囊胚率分別為22.7%(5/22)和0%(0/5)。說明在這些裸卵和疑似成熟卵中，有真正的成熟卵，但只是占很少一部分比例。體外成熟培養6 h組二胞率為5.7%(3/53)，囊胚率為0%(0/3)；體外成熟培養16～18 h組，兩次重復實驗，二胞率分別為18.6%(30/161)和1.3%(1/79)，囊胚率分別為3.3%(1/30)和0%(0/1)。說明在這些裸卵和疑似成熟卵中，只有很少一部分可以在體外成熟培養后獲得受精能力。不管是直接進行體外受精，還是體外成熟培養6 h、16～18 h后進行體外受精，裸卵和疑似成熟卵受精后的二胞率、囊胚率都不盡如人意。分析其原因可能是這部分卵子，由于沒有卵丘顆粒細胞的包裹，所以在體外成熟培養中不能很好地接受成熟因子的調控[8]。然而，只注射PMSG(B組)的卵泡中，大部分是有顆粒細胞包裹的未成熟卵，裸卵只有很少一部分，并且未見到有疑似成熟卵。由此得出結論：注射PMSG和HCG后未排卵卵巢卵泡內大量的裸卵和疑似成熟卵是HCG作用的結果，至于為什么沒有排出原因尚不清楚。

綜上所述，卵母細胞體外成熟(IVM)可以作為生物凈化中小鼠促排卵失敗的一種補救措施，并且可以提高一些珍稀轉基因品系小鼠的卵子利用率。