流式細胞術工業生產中有關細菌檢測的應用

王 丹 王少鵬 馮軍超 徐興魯 邢立超

山東新創生物科技有限公司 山東 濟南 250101

流式細胞術(Flow Cytometry,FCM)從20 世紀60 年代后期創建以來,發展迅速,最初主要用于科學研究和臨床試驗[1],在微生物領域應用較少,并且起步相對較晚,但是近年來,在國外流式細胞術已經廣泛應用于微生物的相關檢測,而國內在這方面的應用則較少。

并且,隨著電子、激光、計算機等方面的快速發展與進步,流式細胞儀也在不斷完善與更新,如今流式細胞儀已經在微生物檢測中扮演著越來越重要的角色。微生物中,特別是細菌,在生產或研究中往往需要對其進行快速測定,并且也需要也對細菌數量、大小、活性等進行多參數分析,而流式細胞儀自身的特性恰好符合這樣的檢測需求[2]。目前,已經有較多相關檢測方法的報道,本文中主要從細菌計數、無菌檢查、生產在線監測等幾個方面,介紹流式細胞儀在工業生產中細菌檢測相關應用。

1 流式細胞儀的結構及工作原理

流式細胞儀的結構一般可以分為5個部分,包括流動室及液流驅動系統、激光光源及光束形成系統、光學系統、信號檢測顯示儲存分析系統、細胞分選系統。

將待測樣本制備成單細胞懸液,經特異性熒光染料染色后放入樣品管中,在氣體的壓力下,進入充滿流動的鞘液。當鞘液壓力和樣品壓力達到一定程度的壓差,在鞘液的約束下細胞排列成單列,由流動室的噴嘴流出,形成細胞注經過激光聚焦區,與入射的激光束垂直想交,經特異的熒光染料染色的細胞被激光激發產生特定波長的熒光。儀器中一系列光學系統,收集熒光等光學信號,由計算機系統進行收集、存儲、顯示并分析被檢測到的各種信號,對各種指標做出統計分析[3]。

2 FCM 在細菌計數中的應用

傳統的細菌計數方法為微生物平板計數法或者顯微鏡計數板計數,雖然這種計數方法適用范圍廣,但是也存在較多難以克服的缺點,如時間長、操作步驟復雜、工作量大等,并且微生物平板計數法僅能對活菌計數,對于失去活性的細菌則無法計數。

而流式細胞術,可以克服傳統計數方法耗時長、操作步驟繁瑣等問題,并且可以區分出細菌的死活,并進行定量分析。王銀環等[4]使用BD FASS Microcount檢測了3種地衣芽孢活菌制劑中的活菌數、芽孢數和芽孢率,測定過程簡單、便捷、快速,并且與傳統的平板計數法相比無顯著性差異,檢測結果穩定可靠；汪沐等[5]建立了熒光原位雜交和流式細胞術結合(FISH-FCM)快速測定肉食品中腸桿菌的方法,與傳統平板培養方法相比,極大的縮短了檢測時間,并且該方法的檢出率為100%,適用性較強；姜凱[6]構建了流式細胞術檢測乳酸菌數量的方法,通過使用PI(碘化丙錠)和SYTO?24兩種熒光染料對死菌和活菌染色,對10多個批次的發酵劑、發酵乳飲料、發酵乳等產品進行了檢測,與現行國標方法進行對比,并無顯著性差異,且重現性好、單個樣品檢測時間不超過5min,極大的縮短了檢測周期,克服了檢測嚴重滯后于生產過程的難題。

此外,劉春春等[7]在對枯草芽孢桿菌的多態異質性分析中,使用BD Influx(spo),對50nm～500nm 標準尺寸微球進行靈敏度分析,結果顯示在對300nm 以上的微粒均具有較高的靈敏度,這解決了細菌休眠體芽孢等小微粒難以精確分析的難題,促進了流式細胞術進一步發展。

3 FCM 在無菌檢測中的應用

在藥品生產中,微生物無菌檢查是控制保證藥品質量的關鍵因素,是生產中必不可少的監測指標。各國藥典中的無菌檢查方法均是通過觀察培養基培養后的混濁情況來判斷產品的無菌情況,此方法同樣具有檢測周期長、操作過程復雜等缺點。

近些年來,國內外已經有出現較多新興方法進行無菌檢查,由于檢測時間快、靈敏度高,流式細胞術也較多的用于無菌檢查。宋光艷等[8]使用SYTO9熒光染料對藥品中的微生物進行熒光標記后,采用流式細胞術對兩種類型(溶液和無菌粉末)注射劑檢測,檢出限均＜10CFU,與藥典法相比,檢出時間比常規方法縮短40%～70%,可作為法定檢查方法的有效補充；Mohr H 等[9]使用噻唑橙熒光染料對10余種細菌進行熒光標記后,使用流式細胞術對PCs(血小板濃縮物)進行檢測,研究顯示,在接種大約1CFU/m L的細菌,37℃孵育的條件下,多數種類細菌在21小時內或更短的時間內可以被檢測到；盧昕等[10]采用流式細胞術對接處鏡護理液進行無菌檢查,結果顯示當污染量在1～109CFU 范圍時,可直接得出含菌量,同時可有效縮短檢出時間。

此外,也有許多其它檢測方法用于無菌檢查,如采用生物熱動力學方法、Q-PCR 方法等[10],與傳統方法相比,均具有縮短檢測周期、操作流程簡單等特點,這極大的提高了生產效率,加快了產品投入市場。

4 FCM 在生產在線監測中的應用

由于生產中終產品的的合格依靠于生產中各個環節的質量控制,因此在生產中實施在線監測具有重要意義。

目前,國外已有研究人員采用流式細胞術對生產中在線監測技術進行了探索。2000年設計了一種強大的流式細胞檢測系統(FI-FCM),通過此檢測系統的在線監測系統,得到了大腸桿菌發酵培養過程的完整生長曲線[8]；亦應用FI-FCM 流式細胞檢測系統,通過頻繁采樣(每5min一次),實現在線、實時監測生物反應器中微生物細菌的生長變化情況；應用具有毫秒分辨率的RT-FCM(Real time Flow Cytometry)流式細胞檢測系統,實時監測生物反應器中多樣微生物的高動態發展過程,文中通過進行4個不同微生物相關研究方向的實驗,證明此檢測系統在對各種生物實驗的廣泛適用性和可以對具有復雜的生物過程如發酵等收集到更加詳細、時間上更加連續的信息,這也有助于工業生產中優良菌株的篩選[3]。

而國內還較少應用流式細胞術對生產過程進行在線監測,更多是應用在海洋生態系統中生物的實時監測[11],如果將FCM 更多的應用在工業生產中,尤其是微生物發酵等過程,能夠更好地收集到菌體發酵多參數的信息,這對整個生產工藝過程的質量控制具有重大意義。

總結

除了在工業生產中,流式細胞術也廣泛應用于在科學研究、臨床檢測、生態環境等各個領域,尤其對一些微小粒子來說,其具有的逐個分析、靈敏、快速、多參數分析等優勢,更是受到了大家的青睞；雖然流式設備一般價格昂貴,前期成本較高,但是相信隨著科技的飛速發展,難題也將逐漸解決,流式細胞術也將有更加廣闊的應用前景。