HER2過表達型乳腺癌中AK4的表達及臨床意義

趙江濤，張 偉，吳吉海，徐文軒，王美祺，陳 靖

(1.保定市第四中心醫院外科，河北 保定 072350； 2.河北醫科大學第四醫院乳腺外科，石家莊 050011；3.天津市腫瘤醫院胰腺腫瘤科，天津 300060)

乳腺癌是全世界女性發病率最高的惡性腫瘤之一，有4種亞型，分別為luminal A型、luminal B型、人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)過表達型和Basal-like型[1-3]。HER2過表達型的乳腺癌攻擊性較強，雖然目前關于HER2過表達型乳腺癌的治療取得了一定進展，但患者往往預后較差，生存期較短[4-8]。近年來靶向治療在該病的治療中顯示出良好的前景，相關的幾種靶向藥物均取得了較好的臨床效果[9-11]。而為了獲得更好的臨床療效，對于HER2過表達型的乳腺癌目前仍迫切需要新的治療靶點。

腺苷酸激酶(adenylate kinases，AK)是一類涉及多種細胞功能的核苷單磷酸鹽激酶[12-13]。AK4是AK家族的成員[14]。既往研究表明，AK4與細胞的增殖和存活相關[15-16]。已有研究報道，AK家族參與多種癌癥的進展[17]。AK4在肺癌、食管癌等侵襲性很強的腫瘤中明顯過表達，并且AK4參與調控缺氧耐受和線粒體活性，進一步影響腫瘤的發生和轉移[17-19]。AK4介導相關信號通路，進一步促進膠質瘤患者的生存，提示其可能影響膠質瘤的進展[20]。盡管AK4廣泛參與腫瘤的發生、發展，但AK4在HER2過表達型乳腺癌中的作用和機制尚不清楚。本研究主要探討AK4在HER2過表達型乳腺癌組織中的表達及臨床意義，以期為HER2過表達型乳腺癌患者的靶向治療提供一定的臨床依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2010年3月至2018年11月保定市第四中心醫院收治的接受乳腺癌根治性切除手術治療的82例HER2過表達型乳腺癌患者的臨床病理資料。所有患者均經病理證實，患者術前未行放化療等輔助治療,術后均應用輔助治療手段控制腫瘤進展，均給予環磷酰胺聯合表柔比星進行化療。患者年齡40～60歲，平均(51±5)歲，其中<50歲者42例，≥50歲者40例；腫瘤分級：低級別46例，高級別36例；腫瘤大小：<2 cm者48例，≥2 cm者34例；腫瘤pTNM分期：Ⅰ～Ⅱ期54例，Ⅲ～Ⅳ期28例；淋巴結轉移38例；脈管內瘤栓34例。隨訪以電話和查閱病歷的方式進行。隨訪起始時間為手術時間結束當日，隨訪截止時間為2018年11月或患者死亡時間。

1.2組織和試劑 82例HER2過表達型乳腺癌患者根治性手術切除的腫瘤和癌旁正常組織(距離腫瘤組織3～5 mm處的乳腺正常組織)標本。AK4抗體為兔抗人多克隆抗體，購自英國Abcam公司(Catalog No:ab131327)，稀釋濃度為1∶200，免疫組織化學二步法檢測試劑盒購自北京中衫金橋生物技術有限公司(PV-6001，通用型二抗)。

1.3免疫組織化學法 采用10%的甲醛固定乳腺癌腫瘤組織，并進行石蠟包埋與切片。切片于75 ℃加熱30 min，隨后用二甲苯脫蠟，并用梯度乙醇(100%，100%，95%，85%，75%)水合。隨后用檸檬酸緩沖液孵育15 min提取抗原，并阻斷內源性過氧化物酶5 min，5%小牛封閉血清封閉切片20 min，隨后使用抗AK4的抗體孵育2 h。然后切片用生物素化的二抗(1∶1 000稀釋，武漢三鷹公司)孵育1.5 h，氧化二氨基聯苯胺(上海Cell Signaling Technology公司)作為顯色劑底物，洗滌染色5 min后用顯微鏡(日本尼康E200生物顯微鏡)采集圖像。

1.4免疫組織化學染色結果判定 AK4蛋白腫瘤細胞陽性率<5%記為0分，5%～25%記為1分，>25%～75%記為2分，>75%記為3分。同時對陽性染色的腫瘤細胞的膜及胞質染色強度進行評分:陰性染色記為0分，弱陽性染色記為1分，中度陽性染色記為2分，強陽性染色記為3分。隨后將陽性細胞百分比的評分和染色強度評分相加，分為高表達(3～6分)和低表達(<3分)。每例患者的腫瘤組織切片選取5個視野觀察，分析陽性率和染色強度，最終結果采用雙盲法進行判斷。

1.5統計學方法 采用GraphPad prism 5軟件對數據進行統計分析，計數資料比較采用χ2檢驗，采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，Log-rank檢驗比較總生存率和無病生存率。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1AK4在HER2過表達型乳腺癌組織中的表達 AK4主要表達于乳腺癌癌細胞的細胞質中，呈棕黃色顆粒狀。AK4在HER2過表達型乳腺癌組織中的陽性高表達率為63.4%(52/82)，免疫組織化學的染色結果見圖1A。82例癌旁組織中未見AK4的陽性高表達，見圖1B。

2.2HER2過表達型乳腺癌組織AK4的表達與臨床病理特征的關系 pTNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的HER2過表達型乳腺癌AK4高表達率高于Ⅰ～Ⅱ期,有轉移的HER2過表達型乳腺癌AK4高表達率高于無轉移者(P<0.05)，不同年齡、腫瘤分級、腫瘤大小及有無脈管瘤栓的AK4高表達率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 82例HER2過表達型乳腺癌患者中AK4表達水平與臨床病理特征的關系 [例(%)]

HER2：人類表皮生長因子受體2； AK4：腺苷酸激酶4

2.3生存分析 高表達組和低表達組的中位總生存時間分別為48.2和59.0個月，中位無病生存時間分別為39.3和100個月，AK4高表達的HER2過表達型乳腺癌患者術后中位生存期短于AK4低表達者(總生存率:χ2=4.891，P=0.021；無病生存率：χ2=6.014，P=0.016)。見圖2。

3 討 論

乳腺癌是發生在乳腺上皮組織中的一種惡性腫瘤，約99%的乳腺癌發生在女性[1-2]。乳腺癌可以在包括小葉在內的乳腺多個部位發生，如果腫瘤進一步侵襲則會擴散轉移到身體的其他部位[1-3]。乳腺癌的4種亞型分別為luminal A型：雌激素受體(+)和(或)孕激素受體(+)、HER-2(-)、Ki-67(-)；luminal B型雌激素受體(+)和(或)孕激素受體(+)、HER-2(-)、Ki-67(+)；HER-2過度表達型：雌激素受體(-)和(或)孕激素受體(-)，HER-2(+)；三陰性即Basal-like型：雌激素受體(-)、孕激素受體(-)、HER-2(-)[3]。HER-2過表達型乳腺癌是乳腺癌的一種亞型，由于細胞異質性、腫瘤易轉移和分子機制的復雜性而導致預后不良[4-6]。HER-2過表達型乳腺癌的傳統治療還依賴于芳香化酶抑制劑和抗雌激素[7-8]。雖然針對其傳統治療取得了一定進展，但總體療效仍欠佳[4-11]。近年來越來越多針對HER-2過表達型乳腺癌的研究正在開展，目的在于發現新的生物標志物和治療靶點[7-8]。HER-2是乳腺癌的重要預后因子，HER-2陽性(過表達或擴增)乳腺癌的發生和轉移與其他亞型乳腺癌不同，治療方法也不同[21-22]。近年來，靶向治療對該腫瘤有較好的療效[23-24]。注射用曲妥珠單抗和拉帕替尼等靶向藥物特異性靶向HER-2基因，對早期和晚期(轉移性)HER-2陽性乳腺癌均有效[25-26]。雖然HER-2是乳腺癌的驅動基因，但仍有一些基因參與HER-2陽性乳腺癌的進展。作為潛在的治療靶點，有必要開發相關靶向藥物，參與聯合治療，以改善HER-2過表達乳腺癌患者的預后[27]。

AK4：腺苷酸激酶4；HER-2：人類表皮生長因子受體2圖2 HER-2過表達型乳腺癌中AK4高低表達的總生存期(2a)和無病生存期(2b)比較

AK是一類涉及多種細胞功能的核苷單磷酸鹽激酶，AK4是腺苷酸激酶家族的成員。既往體外研究結果表明，AK4能與ADP/ATP轉運蛋白相互作用，促進細胞的增殖和存活[15-16]。已有研究報道，AK4在肺癌、食管癌、膠質瘤等腫瘤中存在過表達現象，可能進一步影響腫瘤的發生、進展和轉移[17-20]。本研究結果顯示AK4在腫瘤組織中高表達，且與患者的臨床特征相關。因此，AK4可以作為治療HER-2過表達型乳腺癌的新靶點。

既往研究證實，AK4在肺癌中的異常高表達與肺癌的分期較晚、容易復發及預后不良有關[19]。本研究結果也顯示，乳腺癌腫瘤組織中AK4表達量較高，且AK4的表達與淋巴結轉移、pTNM分期相關。這些臨床分析結果證實AK4在HER-2過表達型乳腺癌進展中的潛在作用。同樣，先前的研究表明AK4在腫瘤發生過程中扮演促癌因子的角色，AK4在多種癌細胞中高表達，促進癌細胞的增殖和侵襲[17-18]。在HER-2過表達型乳腺癌中AK4能否促進癌細胞的增殖和侵襲需要進一步研究和證實。此外，有研究證實，AK4通過依賴于轉錄激活因子3的方式促進肺癌的發展和轉移[19]，而轉錄激活因子3參與不同腫瘤生長的作用已廣泛證實[28]。轉錄激活因子3參與乳腺癌細胞的遷移和侵襲[29-30]。因此，可以提出假說，在HER-2過表達型乳腺癌中可通過調控轉錄激活因子3促進癌細胞的遷移和侵襲，這也是下一步需要進行的機制層面的研究。

綜上所述，HER-2過表達型乳腺癌的惡性程度較高，預后較差。AK4在HER-2過表達型乳腺癌中呈現異常高表達，且其異常高表達提示HER-2過表達型乳腺癌患者的TNM高分期和淋巴結轉移，預示不良的預后。因此，AK4可能是HER-2過表達型乳腺癌治療的新靶點。