多重PCR技術(shù)檢測(cè)食用魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品中β-溶血性嗜水氣單胞菌毒性基因研究

余文杰

摘要? ? 氣溶素和溶血素是β-溶血性嗜水氣單胞菌的重要毒力因子。為建立檢測(cè)食用魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品中β-溶血性嗜水氣單胞菌氣溶素基因（aerA）和溶血素基因（ahh1）的技術(shù)，本文采用多重PCR技術(shù)檢測(cè)28個(gè)來(lái)源于食用魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品的β-溶血性嗜水氣單胞菌樣本（包括鯉魚(yú)片、水、鯽魚(yú)片、鱒魚(yú)片、鰱魚(yú)片、鮭魚(yú)片和帶魚(yú)片），并用標(biāo)準(zhǔn)菌株嗜水氣單胞菌ATCC7965和分離于死蟒蛇的帶有β-溶血性毒素基因的嗜水氣單胞菌作為對(duì)照。結(jié)果表明，所有菌株樣本（100%）被證實(shí)攜帶嗜水氣單胞菌16S rRNA基因（356個(gè)堿基對(duì)），所有嗜水氣單胞菌樣本（100%）被證實(shí)攜帶ahh1毒性基因（130個(gè)堿基對(duì)），26個(gè)嗜水氣單胞菌樣本（93%）被證實(shí)攜帶aerA基因（309個(gè)堿基對(duì)）。本研究證實(shí)β-溶血性嗜水氣單胞菌菌株廣泛存在于供人類(lèi)食用的魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品中，對(duì)消費(fèi)者產(chǎn)生了一定的健康風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞? ? 食用魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品;嗜水氣單胞菌;多重PCR;氣溶素;溶血素

中圖分類(lèi)號(hào)? ? TS254.5? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A? ? ? ? 文章編號(hào)? ?1007-5739（2019）11-0217-02

Abstract? ? Aerolysin and haemolysin are viewed as important virulence factors related to the entero-toxigenicity of β-haemolytic Aeromonas hydrophila. In order to establish a method for detection of genes coding aerolysin（aerA）and haemolysin（ahh1）in β-haemolytic A. hydrophila strains isolated from edible fish products，a multiplex PCR was applied to detect the β-haemolytic A. hydrophila strains isolated from 28 samples of edible fish products（including carp cutlets，water，crucian cutlets，trout cutlets，silver carp cutlets，trout cutlets and hailtail cutlets），and the study used a reference A. hydrophila strain（ATCC 7965）and an A. hydrophila strain isolated from a dead anaconda，as positive controls with strong? β-haemolytic activity. The results showed that the chromosome gene 16S rRNA（356 bp）was confirmed in all A. hydrophila strains（100%），the gene ahh1（130 bp）was confirmed in all A. hydrophila strains（100%），and the gene aerA（309 bp）was confirmed in 26 A. hydrophila strains（93%）. The presence of β-haemolytic A. hydrophila strains in edible fish products cuases a risk to the consumer′s health.

Key words? ? edible fish product;Aeromonsa. hydrophila;multiplex PCR;aerolysin;haemolysin

嗜水氣單胞菌普遍存在于水環(huán)境中，被視為一種機(jī)會(huì)主義病原體，可以引發(fā)人類(lèi)腸胃炎、傷口感染、敗血癥以及魚(yú)類(lèi)的出血性敗血癥。眾所周知，嗜水氣單胞菌在魚(yú)類(lèi)和魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品中流行，因而日常食用的魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品非常容易受到污染，成為傳播病原菌的載體。研究表明，食用魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品的氣單胞菌感染比例可以達(dá)到37.3%～93.0%[1]。氣單胞菌屬的分離鑒定表明，食用魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品中嗜水氣單胞菌是主要的微生物污染源。

嗜水氣單胞菌毒性因子包括溶血素、氣溶素、蛋白酶、脂酶、DNA酶，這些物質(zhì)都是引發(fā)人類(lèi)和魚(yú)類(lèi)疾病的主要發(fā)病因子[2]。嗜水氣單胞菌不僅可以在最佳生長(zhǎng)溫度下形成毒性因子，而且在冰箱條件下也可以形成毒性因子。嗜水氣單胞菌引發(fā)的胃腸炎是最常見(jiàn)的人類(lèi)疾病。從溶血性腸胃炎患者身上經(jīng)常可以分離出嗜水氣單胞菌，其原因主要是患者食用了受病原體污染的食物或水。

嗜水氣單胞菌溶血素屬于一大類(lèi)造孔細(xì)菌溶細(xì)胞素當(dāng)中的一種，會(huì)導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)容物泄漏，從而破壞細(xì)胞膜，最終引發(fā)細(xì)胞死亡。嗜水氣單胞菌目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在2種主要的溶血性毒素，包括溶血素和氣溶素[3]。氣溶素是一種細(xì)胞外的可溶性親水蛋白，表現(xiàn)出溶血特性和細(xì)胞溶解特性，可以綁定到真核細(xì)胞的特定糖蛋白受體表面，從而形成毛孔。有研究顯示， β-溶血性嗜水氣單胞菌可以引起廣泛存在于兔回腸循環(huán)的積液[4]。同時(shí)有研究表明，2種β-溶血性嗜水氣單胞菌的毒素蛋白都是由具有強(qiáng)毒性的基因負(fù)責(zé)翻譯生產(chǎn)。aerA基因翻譯生產(chǎn)的溶血素蛋白廣泛存在于產(chǎn)毒素的菌株中。從食物和水分離得到的氣單胞菌屬菌株通常包含有毒素基因。基于此，本文研究了基因編碼的氣溶素和溶血素是否存在于人類(lèi)食用魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品中，并且證實(shí)是否屬于β-溶血性嗜水氣單胞菌，以期為其控制做出比較好的研究基礎(chǔ)。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 供試菌株

本試驗(yàn)是通過(guò)從食用魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品中分離得到β-溶血性嗜水氣單胞菌，采用API20NE生化特性對(duì)其進(jìn)行鑒定，樣本包括鯉魚(yú)片（n=132）、水（n=6）、鯽魚(yú)片（n=20）、鱒魚(yú)片（n=11）、鰱魚(yú)片（n=20）、鮭魚(yú)片（n=20）和帶魚(yú)片（n=20）。對(duì)照菌株是嗜水氣單胞菌ATCC7965，購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)菌種保存實(shí)驗(yàn)室。同時(shí)采用分離于死蟒蛇的含有β-溶血性毒素基因的嗜水氣單胞菌作對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)室分離純化和保存所有的菌株。

1.2? ? 供試培養(yǎng)基與試劑

培養(yǎng)基和化學(xué)品是從上海一基實(shí)業(yè)有限公司購(gòu)買(mǎi)獲取，PCR試劑盒是從深圳市長(zhǎng)征生物科技有限公司購(gòu)買(mǎi)獲取。引物的制備是根據(jù)前人描述的方法開(kāi)展。引物是由大連寶生物工程公司進(jìn)行合成，具體見(jiàn)表1。

1.3? ? 試驗(yàn)菌株DNA提取

細(xì)菌DNA制備過(guò)程是根據(jù)制造商的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司）來(lái)開(kāi)展。

1.4? ? PCR反應(yīng)條件

多重PCR反應(yīng)包括3對(duì)引物。PCR反應(yīng)混合物（25 μL）中包含：12.5 μL Taq酶和1.0 μL ahh1引物，1.0 μL aerA引物，0.2 μL 16S rRNA引物和1 μL提取DNA，余量為雙蒸水。

使用PCR儀器（ABI-2720，美國(guó)貝登儀器公司）進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件：95 ℃初始變性5 min，95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，50個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。

1.5? ? 電泳檢測(cè)

將擴(kuò)增的DNA片段放置在2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行水平電泳，使用1xTAE緩沖溶液（0.04 MTris，0.02 mol/L醋酸，0.002 mol/L Na2EDTA）、100 V、45 min，使用8 μL PCR產(chǎn)物。

凝膠使用溴化乙錠1 μL/mL進(jìn)行染色30 min，紫外線光照下觀察。

基因標(biāo)準(zhǔn)品是采用100個(gè)堿基對(duì)的DNA梯度標(biāo)記物（上海啟發(fā)試驗(yàn)試劑有限公司），從而對(duì)其分子量進(jìn)行識(shí)別。

2? ? 結(jié)果與分析

食用魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品中β-溶血性嗜水氣單胞菌的發(fā)病情況如表2所示。經(jīng)過(guò)多重PCR證實(shí)，28個(gè)β-溶血性嗜水氣單胞菌樣本都攜帶有染色體基因16S rRNA。所有嗜水氣單胞菌樣本（100%）都攜帶有ahh1基因。26個(gè)（93%）的嗜水氣單胞菌樣本攜帶有aerA基因。aerA基因不存在于1個(gè)（25%）鯉魚(yú)片和1個(gè)（17%）帶魚(yú)片中（表3）。16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（356個(gè)堿基對(duì)）、ahh1基因擴(kuò)增產(chǎn)物（130個(gè)堿基對(duì)）、aerA基因擴(kuò)增產(chǎn)物（309個(gè)堿基對(duì)）以及多種食用魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品中β-溶血性嗜水氣單胞菌的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

3? ? 結(jié)論與討論

近幾年，PCR是用于檢測(cè)食品微生物病原體的首選方法，主要原因是其具有速度快、高敏感性和特異性等特點(diǎn)[5]。此外，使用特定的毒力基因引物可以將致病性菌株和非致病性菌株區(qū)分開(kāi)。在本研究中，使用特定的引物來(lái)證實(shí)嗜水氣單胞菌氣溶素和溶血素基因的存在，并證實(shí)這些是主要毒力因子。研究人員普遍認(rèn)為，氣單胞菌屬感染的發(fā)病機(jī)制是多因素和多毒力因子綜合作用的結(jié)果[6]。一個(gè)毒力因子或其中幾個(gè)的組合可以在不同氣單胞菌屬中存在并產(chǎn)生相應(yīng)的毒性。正是如此，還需要更多的研究來(lái)區(qū)分存在于不同氣單胞菌屬的幾個(gè)毒力因子，有助于更好地理解氣單胞菌屬感染的發(fā)病和流行病學(xué)機(jī)理。因此，在過(guò)去的幾年中，前人的研究主要集中在溶血素作為氣單胞菌屬的主要毒力因子。許多研究人員證實(shí)溶血性因子是其致病機(jī)理，最深入研究的是溶血素和氣溶素。

氣溶素是溶血性毒素，aerA基因負(fù)責(zé)編碼并起著關(guān)鍵作用，從而引起魚(yú)類(lèi)感染。氣溶素是嗜水氣單胞菌致病的主要毒力因子，會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，進(jìn)而致魚(yú)表皮和內(nèi)臟出血。研究發(fā)現(xiàn)，氣溶素存在于所有出血性敗血病魚(yú)體分離得到的嗜水氣單胞菌以及從60%的健康魚(yú)嗜水氣單胞菌菌株分離得到[6]。

根據(jù)前人研究，一個(gè)氣單胞菌屬菌株可以同時(shí)攜帶編碼幾個(gè)毒力因子的基因[7]。本文研究發(fā)現(xiàn)，ahh1基因存在于食用魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品的41%溫和氣單胞菌和55%嗜水氣單胞菌中。aerA和ahh1基因被發(fā)現(xiàn)在68%嗜水氣單胞菌中存在。此外，即使只有aerA基因，β-溶血性嗜水氣單胞菌也表現(xiàn)出細(xì)胞毒性特性。不同的是，溶血性溫和氣單胞菌和非溶血性嗜水氣單胞菌沒(méi)有攜帶aerA基因。而分離來(lái)自于淡水魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品53%的嗜水氣單胞菌被發(fā)現(xiàn)含有aerA基因。分離來(lái)自海洋魚(yú)類(lèi)分離得到的89%嗜水氣單胞菌發(fā)現(xiàn)存在氣溶素基因aerA和溶血素基因hlyA。同樣的研究結(jié)果也證實(shí)，新鮮的鮭魚(yú)、鱒魚(yú)魚(yú)片和切片以及真空包裝的熏制鱒魚(yú)和鮭魚(yú)片中分離得到的嗜水氣單胞菌都含有aerA基因，而92%的樣本含有hlyA基因[8]。前人研究表明，冷凍魚(yú)分離得到的β-溶血性嗜水氣單胞菌株都含有氣溶素基因[9]。相反的結(jié)果是，壽司、水生生物沙拉、魚(yú)肉醬和蝦分離得到嗜水氣單胞菌沒(méi)有發(fā)現(xiàn)溶血素基因和氣溶素基因[8]。本研究中，β-溶血性嗜水氣單胞菌檢測(cè)結(jié)果都含有ahh1基因，而93%的樣本含有aerA基因，其中1株從鯉魚(yú)片和1株從帶魚(yú)片分離得到的菌株均沒(méi)有攜帶aerA基因。

前人研究表明，嗜水氣單胞菌污染的魚(yú)和魚(yú)產(chǎn)品都可以引發(fā)人體的腹瀉[10]。大多數(shù)情況下，此類(lèi)疾病與水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品或冷藏食品直接食用息息相關(guān)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，氣單胞菌屬菌株與其他菌株相比較，同時(shí)攜帶有ahh1和aerA基因的菌株具有更高的細(xì)胞毒性滴度[11]，從而證實(shí)β-溶血性嗜水氣單胞菌氣溶素是一種重要的毒力因子。嗜水氣單胞菌的致病性是多因素造成的，可能取決于各種毒性因子的協(xié)同效應(yīng)。在前人研究中，發(fā)現(xiàn)所有分離來(lái)自魚(yú)的嗜水氣單胞菌菌株含有aerA（100%）和分離來(lái)自腹瀉患者的菌株含有hlyA（83%）基因。溶血素也是人類(lèi)氣單胞菌屬感染的發(fā)病機(jī)理重要組成成分。前人研究表明，從腹瀉病人的糞便中分離出6個(gè)嗜水氣單胞菌菌株都含有β-溶血性ahh1基因，1/2的菌株同時(shí)含有氣溶素編碼基因[12]。

考慮到免疫活性差和免疫力低下的人群越來(lái)越多，有可能受到氣單胞菌屬感染潛在風(fēng)險(xiǎn)，而且廣泛的氣單胞菌屬存在于環(huán)境中，長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)潛在致病性氣單胞菌屬有助于公眾健康。本研究表明，毒性嗜水氣單胞菌的PCR鑒定方法相比傳統(tǒng)的微生物鑒定方法，非常有用，具有敏感、快速的特點(diǎn)。本研究結(jié)果證實(shí)，嗜水氣單胞菌菌株存在毒力基因編碼毒力因子。這些菌株是危險(xiǎn)的，有可能導(dǎo)致食物中毒。食用魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品的安全性受到眾多因素的影響，包括魚(yú)的來(lái)源、魚(yú)的特性和加工方法。新鮮的魚(yú)經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)募訜徇M(jìn)行食用是低風(fēng)險(xiǎn)的，然而如果食用生魚(yú)，不夠熟或僅進(jìn)行簡(jiǎn)單處理會(huì)增加食用風(fēng)險(xiǎn)。食用魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品含有嗜水氣單胞菌對(duì)人類(lèi)是危險(xiǎn)的，特別是對(duì)敏感的人群，例如兒童、老年人和免疫功能不全的人。

本研究證實(shí)人類(lèi)食用的魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品存在β-溶血性嗜水氣單胞菌。此外，研究發(fā)現(xiàn)，所有這些菌株攜帶ahh1基因，多數(shù)β-溶血性嗜水氣單胞菌攜帶aerA基因，從而證實(shí)β-溶血性嗜水氣單胞菌溶血素基因和氣溶素基因普遍存在于魚(yú)類(lèi)和魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品中，對(duì)消費(fèi)者的健康造成潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，有必要通過(guò)多重PCR檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行快速有效的β-溶血性嗜水氣單胞菌的分離鑒定，預(yù)防其對(duì)人體產(chǎn)生危害。

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基金項(xiàng)目? ?福建省科技廳科學(xué)研究項(xiàng)目（JK2012012）。

作者簡(jiǎn)介? ?余文杰（1977-），男，福建漳州人，碩士，講師，從事生物科學(xué)的教學(xué)及科研工作。

收稿日期? ?2019-02-22