雙季稻田冬閑期土壤細菌數量及結構對施氮的響應

聶江文，王幼娟，吳邦魁，劉章勇，朱 波*

（1 主要糧食作物產業化湖北省協同創新中心，湖北荊州 434025；2 長江大學濕地生態與農業利用教育部工程研究中心/湖北省澇漬災害與濕地農業重點實驗室，湖北荊州 434025）

水稻 (Oryza sativa) 是我國重要的糧食作物之一，稻田土壤質量的可持續性對水稻持續高產穩產有著極其重要的作用。氮肥的施入對水稻產量的提升有著巨大的貢獻[1]。據統計，稻田氮肥施用量達到我國氮肥總消費量的30%以上[2]。雖然稻田氮肥的大量施入可以在短期內迅速提升水稻產量，但不合理的施氮措施將導致氮肥的利用效率低下[3]、土壤板結、土壤性質改變[4]、氮素流失加快[5]以及溫室氣體排放增加[6]，對生態環境造成嚴重的影響。此外，無機氮肥在為作物生長提供必需養分的同時[7]，對土壤微生物的群落結構和數量也產生重要影響[8]，土壤微生物作為農田生態系統的重要組分，對于促進土壤有機質的分解以及土壤養分的轉化具有關鍵作用，進而維持土壤質量的可持續和土壤的健康發展[9]。

研究發現，不同的種植制度、施肥措施和土壤理化性質的改變等均會對土壤細菌群落數量及結構造成影響[10-11]，其中，影響最為顯著的是氮肥施用與土壤pH的改變。Zhou等[12]研究表明，土壤pH下降、細菌菌群的結構和數量變化與長期氮肥施用有關；RAMIREZ等[13]研究發現，高氮量肥料的施用會導致土壤中細菌群落組成發生明顯變化，并造成土壤中主要細菌生活史的改變；秦杰等[14]采用高通量測序方法研究表明，在長期不同施肥條件下土壤細菌和古菌的群落結構都發生了顯著改變。目前大量的科研工作主要集中于施氮對作物生育期內土壤理化性質的影響以及土壤肥力生物學特征的評價，而對施氮后冬閑期土壤質量的評價較為少見，缺少施用氮肥后對冬閑期稻田土壤的細菌數量與結構影響的研究。

以3種氮肥水平下的雙季稻田耕層土壤為研究對象，采用real-time PCR技術和高通量測序技術(Illumina HiSeq)，探討不同施氮處理對稻田冬閑期土壤細菌的數量及群落結構產生的影響，并分析土壤菌群與環境因子的相關關系，為進一步了解施氮對雙季稻田土壤細菌群落結構的變化的影響和雙季稻區水稻可持續生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況及試驗設計

試驗在湖南省華容縣長江大學試驗基地 (東經112o55′、北緯 29o52′) 進行。當地氣候為亞熱帶季風濕潤氣候，年均氣溫16℃～18℃，≥ 10℃積溫5000℃～5800℃，無霜期260～310 d，年降雨量1200～1700 mm。試驗土壤類型為長江沉積物發育形成的紫潮泥水稻土。試驗前土壤肥力指標如下：有機質含量49.2 g/kg、全氮含量3.11 g/kg、堿解氮273 mg/kg、有效磷16.4 mg/kg、速效鉀69 mg/kg、pH 7.7。

長期施氮試驗始于2008年，耕作制度為冬閑-雙季稻，試驗設計：雙季不施氮 (CK)、每季各施N 100 kg/hm2(N1)、每季各施N 200 kg /hm2(N2)。每季磷肥 (P2O5) 施用量均為75 kg/hm2，鉀肥 (K2O) 均為100 kg/hm2，氮肥、磷肥和鉀肥分別為尿素、磷酸二氫鈣和硫酸鉀。每個處理3次重復，小區面積29.7 m2(長9.0 m、寬3.3 m)，隨機區組排列。

1.2 土壤樣品采集及土壤化學性質測定

于2016年3月稻田冬閑期 (田間表層無水) 采集5—20 cm土樣，每個小區隨機選取3個樣點，剔除樣品中所含的石砂和植物殘渣等大塊雜物，混合均勻后用聚乙烯封口袋儲存。用于土壤微生物群落分析的土樣用錫箔紙包裹后迅速轉移至液氮中，冷藏于-80℃冰箱；用于測定銨態氮和硝態氮的鮮土壤樣品裝入聚乙烯封口袋冷藏于4℃冰箱；剩余土壤樣品待自然風干后測定土壤pH、全碳和全氮含量。

采用酸度計法測定土壤pH (土水比1∶2.5)；采用 2 mol/L KCl浸提—靛酚藍比色法測定銨態氮；采用雙波長紫外分光光度法測定硝態氮；采用堿解擴散法測定堿解氮；用元素分析儀 (型號Costech ECS 4024 CHNSO，NC Technologies，意大利) 測定全氮和全碳。

1.3 土壤總DNA提取

用DNA試劑盒 (MOBIO Laboratories Inc.，Carlsbad，CA，USA) 法提取0.25 g鮮土中的總DNA。DNA純化及檢測參考文獻[15]進行。

1.4 PCR擴增及Illumina高通量測序技術

使用Illumina Hiseq平臺進行PCR擴增和測序，測序引物選擇16s rDNA基因V4區338F (5′-ACTC CTACGGGAGGCAGCA-3′) 和 806R (5′-GGACTA CVSGGGTATCTAAT-3′)，兩端引物都加有barode序列標簽 (12 mer)。PCR擴增體系參考文獻[15]配制。

1.5 熒光定量PCR

使用ABI 7500 (ABI，USA) 實時熒光定量PCR系統測定細菌16s rDNA基因豐度。反應體系：SybrGreen qPCR Master Mix (2X) 15.5 μL，引物 338F(10 μmol/L) 0.8 μL，引物 806R (10 μmol/L) 0.8 μL，Template (cDNA) 2 μL，補加 ddH2O 至 20 μL。PCR循環條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，40個循環，55℃ 1 min，40個循環。

1.6 數據分析

高通量測序所得的數據進行優化、去雜和OTU分類 (相似度 ＞ 97%)，具體方法參考文獻[15]。然后進行分類學分析，即以Silva的16s rDNA基因數據庫 (http：//www.arb-silva.de/) 為參考數據庫，進行RDP (Ribosomal database project) Classifier[16]序列比對，最低置信度為0.80。

1.7 統計分析方法

采用Excel 2007和SPSS 19.1軟件對數據進行方差分析及作圖，并使用SPSS 19.1軟件對土壤化學性質與土壤微生物群落數量及結構進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 水稻產量

如表1所示，不同施氮處理下雙季稻產量存在顯著差異 (P＜ 0.05)。與CK相比，N2和N1均顯著增加了早稻、晚稻產量，而N1與N2間產量不存在顯著差異。

表1 不同施氮水平下水稻產量 (kg/hm2)Table 1 Rice yields affected by different nitrogen application rates

2.2 土壤化學性質

不同施氮處理稻田冬閑期土壤化學性質存在顯著差異 (表2)。不同施氮處理土壤pH為7.22～7.63之間。與CK相比，施氮顯著降低了冬閑期土壤pH。與CK相比，施氮肥 (N1、N2) 顯著提升了土壤的總氮、全碳，降低了硝態氮、碳氮比 (P＜0.05)，對堿解氮的影響不顯著。與CK相比，N1處理顯著降低了冬閑期土壤的銨態氮含量，而N2處理顯著增加了稻田冬閑期土壤銨態氮。

2.3 土壤總細菌的豐度

施加氮肥顯著增加了稻田冬閑期土壤的總細菌豐度 (圖1)。CK、N1、N2處理每克干土中細菌16s rDNA 的基因拷貝數依次為 1.7×108、80×108、67×108，N1處理是CK的48.25倍，N2處理是CK的40.31倍。土壤16s rDNA基因豐度與土壤化學性質的 Spearman 相關性分析結果顯示，稻田土壤細菌數量與土壤全氮呈極顯著正相關(0.89**)，與土壤全碳呈顯著正相關(0.87*)，與土壤碳氮比呈顯著負相關(-0.86*)，而與其他四個土壤化學性質指標無相關性。

表2 不同氮肥水平下雙季稻田土壤化學性質Table 2 Chemical properties of double cropping rice fields affected by different nitrogen application rates

圖1 不同施氮水平下土壤細菌16s rDNA基因拷貝數Fig.1 Copies of bacterial 16s rDNA genes in soils with different nitrogen application rates

2.4 測序結果和多樣性指數

表3所示，對16s rDNA基因測序所得的序列進行分析，每個樣品含18513～24016條序列數，1732～1788個OTUs數。樣品測序覆蓋度在0.9826～0.9891，所獲得樣品稀釋性曲線如圖2，曲線均趨于平坦飽和，表明在此測序深度所得序列數據量可以充分反映冬閑期土壤樣品微生物信息。

表3表明，N2處理的Ace指數顯著高于CK、N1處理（P＜0.05），CK與N1差異不顯著。各處理Chao l指數在1937～1957之間，CK與施氮處理間差異不顯著，N2處理顯著高于N1（P＜0.05）。雖然Ace指數與Chao1指數因算法不同而導致結果略有差異，但兩者的結果都說明了施氮并沒有改變土壤細菌的豐富度，但不同施氮水平間存在差異。香農(Shannon)指數和辛普森(Simpson)指數結果顯示，N2處理香農指數顯著低于CK，但其辛普森指數顯著高于CK；N1處理香農指數顯著高于CK，但其辛普森指數顯著低于CK。這說明與CK相比，N1處理對稻田土壤細菌的豐富度無顯著影響，但會提高稻田土壤細菌的多樣性；N2處理顯著增加了稻田土壤細菌的豐富度，但顯著降低了稻田土壤細菌的多樣性。

2.5 土壤細菌群落優勢菌群差異

圖3a 顯示，Proteobacteria (變形菌門) 是所有處理中門水平相對豐度最高的群落，達40.16%～51.16%，隨后依次是Chloroflexi (綠彎菌門) 13.69%～19.73%、Nitrospirae (硝化螺旋菌門) 8.16%～11.46%、Acidobacteria (酸桿菌門) 5.65%～12.25%、Bacteroidetes (擬桿菌門) 4.32%～5.23%、Actinobacteria (放線菌門) 2.25%～2.68%、Chlorobi(綠菌門) 1.68%～2.52%、Gemmatimonadetes (芽單胞菌門) 1.6%～2.13%、Latescibacteria 0.92%～1.51%、Parcubacteria 0.72%～1.05%、Cyanobacteria (藍藻門)0.71%～2.71%、Firmicutes (厚壁菌門) 0.47%～0.97%。其中，N1處理的綠彎菌門、酸桿菌門以及放線菌門細菌的相對豐度均顯著高于CK，而N1處理的變形菌門、硝化螺旋菌門以及擬桿菌門細菌的相對豐度均略低于CK；N2處理的變形菌門和硝化螺旋菌門細菌的相對豐度均顯著高于CK及N1，但其綠彎菌門和酸桿菌門細菌相對豐度均顯著低于CK及N1。可見，施氮改變了稻田土壤細菌門水平群落結構。

表3 不同施氮水平下土壤細菌測序結果、豐富度及多樣性Table 3 Sequencing, reichness and diversity indices of soils with different nitrogen application rates

圖2 不同處理土壤OTUs的稀釋性曲線 (相似度97%)Fig.2 Rarefaction curves of the OTUs number at 97%similarity for different soil samples

3個施氮處理土壤細菌相對豐度最高的10個屬水平菌群分類如圖3b所示，屬水平菌群相對豐度最高的是Anaerolineaceae_uncultured(厭氧繩菌屬) 和Nitrospira(硝化螺旋菌屬)，其相對豐度分別是8.6%～14.56% 和8.16%～11.46%。隨后依次是Sva0485_norank(2.71%～4.5%)、Nitrosomonadaceae_uncultured(3.05%～3.54%)、43F-1404R_norank(1.98%～4.99%)、Sh765B-TzT-29_norank(2.97%～3.11%)、Subgroup_6_norank(1.89%～6.06%)、B1-7BS_norank(1.93%～2.24%)、Alcaligenaceae_uncultured(1.82%～1.91%)、GR-WP33-30_norank(1.58%～1.88%)。其中，N1處理硝化螺旋菌屬相對豐度顯著高于N2及CK (P＜ 0.05)，N2處理硝化螺旋菌屬相對豐度顯著低于CK。可見，不同施氮水平均改變了稻田土壤細菌的屬水平群落結構。

2.6 土壤細菌門水平群落結構與土壤化學性質的相關性分析

土壤化學性質與土壤優勢門水平菌群相對豐度的Spearman相關性分析顯示 (表4)，11個優勢門水平菌群均與土壤化學性質存在顯著的相關性。綠彎菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、綠菌門和Latescibacteria與土壤pH呈顯著負相關；放線菌門與土壤總氮呈顯著正相關，Parcubacteria和藍藻門與土壤總氮呈顯著負相關；硝化螺旋菌門和厚壁菌門與土壤堿解氮呈顯著正相關，芽單胞菌門與土壤堿解氮呈顯著負相關；Parcubacteria和藍藻門與土壤硝態氮呈顯著正相關；芽單胞菌門與土壤銨態氮呈顯著負相關，厚壁菌門與土壤銨態氮呈顯著正相關；放線菌門與土壤碳氮比呈顯著負相關；Parcubacteria和藍藻門與土壤全碳呈顯著負相關。

3 討論

3.1 施氮對水稻產量及稻田土壤化學性質的影響

圖3 不同施氮水平下土壤細菌門 (a) 和屬 (b) 的相對豐度Fig.3 Relative abundance of soil bacteria at phylum (a) and genus (b) affected by different nitrogen application rates

表4 土壤優勢菌群門相對豐度與土壤化學性質的 Spearman 相關性分析Table 4 Spearman's correlation coefficients between soil dominant bacteria (phylum) and soil physiochemical characteristics

施加氮肥除了可以顯著提高水稻產量，還對土壤的化學性質產生顯著影響。本研究中，各施肥處理土壤pH在7.22～7.63之間，與CK相比，施氮均顯著降低稻田土壤pH。而多數研究結果表明，氮肥的過量施用會導致土壤pH降低，土壤酸化[14,17-18]，這與本研究結果相一致。與CK相比，施氮肥 (N1、N2) 能顯著提升土壤的總氮、全碳，但降低了土壤的硝態氮、碳氮比 (P＜ 0.05)，這與秦杰等[14]的研究結果相似，氮肥的投入可提升土壤的供氮能力，與此同時氮肥影響水稻的生長，促進水稻根系的生長并逐年累積在稻田土壤中，造成土壤全碳的增加。施氮促進根系的生長[19]，并且會導致根系硝酸還原酶活性增加[20]，消耗土壤中的硝態氮，從而導致施氮條件下硝態氮降低。與不施氮肥 (CK) 相比，N1處理顯著降低了土壤銨態氮水平，N2處理顯著增加了土壤銨態氮，這可能是由于氮肥的投入促進了水稻對土壤速效氮的吸收，而N2處理本身施氮量高于N1處理，其氮肥供應能力也強于N1處理。

3.2 施氮對稻田土壤細菌數量和多樣性的影響

土壤微生物活性可用土壤細菌的數量來表征。本研究中不同施肥處理細菌16s rDNA基因拷貝數為每克干土 1.7 × 108～80 × 108個，遠低于 Shen 等[21]在水稻田中1010數量級的細菌數量和楊亞東等[22]發現華北平原小麥土壤細菌數量 5.74 × 109～7.5 × 109，這可能與土壤類型[23]和種植作物[24]有關。在旱地土壤中，長期施用氮肥往往降低或不會顯著影響細菌數量[22,24]。本研究發現施氮顯著增加冬閑期稻田土壤細菌的數量，且細菌數量與土壤全氮和全碳含量呈顯著相關，袁紅朝等[25-26]在水稻土的研究結果也是如此。其主要原因是施氮為水稻的根系生長提供了充足的氮營養，促進根系生長，水稻收割后根系可為土壤細菌提供持久全面的養分和更多的碳源、能源，更利于土壤細菌的生長[27-28]。而旱地與水稻田的土壤類型不同可能是導致施氮造成不同影響的主要原因[23]。

施氮改變了細菌的多樣性指數，但不同氮水平對其影響并不一致。王佩雯等[29]研究發現，煙草連作條件下土壤細菌群落多樣性對施肥的響應并不明顯，而Zhou等[12]研究發現，長期施用氮肥導致東北黑土土壤微生物多樣性降低。周嵐等[30]研究發現，低氮與不施氮相比，土壤細菌的多樣性及豐富度差異不大，但高氮與低氮及不施氮肥間存在較大差異，說明不同施氮水平對于土壤細菌的多樣性及豐富度的影響并不一致，與本研究結果相一致。

3.3 施氮對稻田土壤細菌群落結構的影響

變形菌門、綠彎菌門、硝化螺旋菌門、酸桿菌門、擬桿菌門和放線菌門是三個施氮處理中的優勢門類群，所有處理中變形菌門相對豐度均高達40%以上，表明變形菌門有較強的適應能力。Fierer等[31]和Deangelis等[32]的研究推測，變形菌門在各種植物的根際土壤中快速增長是其在各種植物根際微生物中占優勢的主要原因。袁紅朝等[26]、高圣超等[33]研究結果表明施氮增加變形菌門的相對豐度，而本研究顯示施高量氮顯著增加變形菌門的相對豐度，但是低氮則略微降低其豐度，這與于海玲[34]的研究相一致。硝化螺旋菌門是一種與生物固氮相關的細菌，本研究中，硝化螺旋菌門對于氮肥的響應與變形菌門一致。此外，酸桿菌門在本研究中也是優勢菌落，這與前人[15]研究結果相一致，且酸桿菌門的活性與土壤pH密切相關[31]，而本研究結果顯示，施低量氮略微增加了酸桿菌門的相對豐度，而高氮則顯著降低其豐度，這與王伏偉等[35]研究結果相一致，表明土壤中酸桿菌門不僅受到土壤pH的影響，還可能與其他理化性質存在一定的關系[36]。土壤中的放線菌門能夠加速動植物殘體的分解，同時在氮循環過程中也發揮著一定的作用[37]。本研究結果顯示，施氮顯著增加放線菌門的相對豐度，且放線菌門與土壤全氮呈顯著正相關，這與王伏偉等[35]研究相一致。

李妙婉[38]發現厭氧繩菌屬和硝化螺旋菌屬是曝氣生物濾池處理污水過程中的優勢微生物群落，與本研究結果相一致，可見厭氧繩菌屬和硝化螺旋菌屬有著極強的適應能力，可適應不同生態環境。此外，相關性分析顯示11個優勢門水平菌群均與土壤化學性質存在顯著相關性。這與袁紅朝等[26]、高圣超等[33]、秦杰等[14]的研究結果相一致，施肥是導致土壤中微生物結構與數量改變的主要原因之一。本研究僅對雙季稻種植制度冬閑期的土壤微生物進行了研究，缺少早稻季及晚稻季土壤微生物對氮肥響應的研究，今后將更加系統地對雙季稻系統土壤微生物進行研究。

4 結論

施氮降低了冬閑期稻田土壤的pH和C/N比，顯著增加了稻田冬閑期土壤細菌數量。但是較高的施氮水平會降低土壤細菌的群落結構及多樣性。因此，對于湖南雙季稻區可持續發展應適當減少無機氮肥的施用。