甘蔗宿根矮化病感病與非感病株根際土壤生物學性狀及細菌群落結構特征

楊尚東，郭 霜，任奎喻，龐師嬋，張傳進，王帥帥，譚宏偉

（1 廣西大學農學院，廣西南寧 530004；2 廣西農業科學院/廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室，廣西南寧 530007）

甘蔗是世界上最主要的糖料作物，甘蔗糖約占世界食糖總產量的75%，而在我國則占到90%以上。廣西是中國甘蔗的主要生產基地，甘蔗種植面積占全國糖料生產面積的54.6%，生產的食糖占全國的63.4%[1]。我國蔗區 (尤其是廣西、云南) 甘蔗病害病原種類復雜多樣，目前嚴重危害我國甘蔗生產的主要病害有宿根矮化病、黑穗病、病毒病、白葉病等[2]。

甘蔗宿根矮化病 (ratoon stunting disease，RSD)是一種普遍存在于蔗區的世界性病害[3]。干旱條件下，部分易感病品種的宿根蔗產量損失可達50%以上[4]。其首次發現是1944—1945年在澳大利亞昆士蘭的甘蔗品種Q28上[5]。甘蔗宿根矮化病病原菌[6]是Leifsonia xylisubsp.xyli (Lxx)，寄生于蔗株的木質部導管中，可以侵染甘蔗屬所有已知品種，但不侵染其他植物[7]。Lxx病原細菌特別細小，分離、培養和檢測都極其困難，給研究帶來很大難度[8]。甘蔗感染宿根矮化病后，植株矮化、蔗莖變細、生長緩慢、分蘗少，一般可造成減產12%～37%[9]。由于RSD外部癥狀易與干旱、營養不良等癥狀混淆，極易造成病害在田間蔓延，而且RSD所造成的損失隨著宿根年限的延長而增加，對甘蔗生產危害極大[10]。針對廣西甘蔗主產區的調查發現，9個甘蔗主產區樣品均檢出RSD，2018年和2019年榨季栽培面積達673.1萬畝 (約44.9萬 hm2) ，占比近40%的主栽品種新臺糖22 (ROC22) 發病嚴重，檢出率達80.8%，當前廣西甘蔗RSD發病嚴重，亟需推廣綠色防控RSD技術和選育抗性強的品種。

因此，本試驗通過比較分析甘蔗RSD感病株和非感病植株根際土壤生物學性狀與細菌群落結構特征，探究RSD感病株根際微環境特點，旨在為構建甘蔗根際健康微環境提供技術參數，同時為篩選甘蔗RSD的生防細菌提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

甘蔗及土壤樣品采集于本課題組長期定位試驗區，分別位于廣西壯族自治區柳州市柳江區(E 109°27′ 06″，N 24°43′ 40″) 和賓陽縣廖平農場六大隊 (E 108°99′ 93″，N 23°41′ 07″)。甘蔗品種均為‘桂糖42號 (GT42)’。兩個定位試驗區栽植的甘蔗均為三年宿根甘蔗，為掌握宿根矮化病感病株根際土壤的生物學與細菌多樣性特征，兩個定位試驗區均采用相同的常規栽培技術進行管理。

采樣時分別在兩區域選取2個地塊，共4個地塊，每個地塊隨機選取甘蔗植株9～10株，共37株，連根挖取后帶回實驗室。柳州市柳江區的定位試驗地土壤pH 6.02、有機質28.05 g/kg、全氮1.86 g/kg、全磷0.51 g/kg、全鉀14.57 g/kg、速效磷28.2 mg/kg、速效鉀87.3 mg/kg；賓陽縣試驗地土壤pH 5.69、有機質20.5 g/kg、全氮1.02 g/kg、全磷0.57 g/kg、全鉀14.0 g/kg、速效磷13.4 mg/kg、速效鉀53.6 mg/kg。

甘蔗植株RSD鑒定由廣西壯族自治區農業科學院甘蔗研究所重點實驗室完成。甘蔗根際土壤采用抖根法[11]收集于無菌袋中，平均分為2份，一份放置于4℃冰箱中冷藏，用于生物學性狀分析；另一份放于-80℃保存，用于細菌群落結構分析。

1.2 土壤生物學性狀分析

土壤中C、N、P循環相關酶β-葡糖苷酶 (βglucosidase) 活性測定采用Hayano[12]的方法；氨肽酶(Aminopeptidases) 活性測定采用Ladd[13]的方法；磷酸酶 (Phosphatase) 活性測定采用Tabatabai等[14]的方法。土壤微生物生物量碳、氮和磷測定采用氯仿熏蒸提取—容量分析法[15]、茚三酮比色法[16]和磷鉬藍比色法[17]。

1.3 土壤細菌多樣性分析

土壤細菌多樣性分析由上海美吉生物醫藥科技有限公司測序完成，測序具體類型與序列如表1。測序具體流程如下。

DNA抽提和PCR擴增：根據E.Z.N.A.?soil試劑盒(OmegaBio-tek，Norcross，GA，US)說明書進行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量；用 338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對V3～V4可變區進行PCR擴增，擴增程序為95℃預變性3 min，27個循環 (95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s)，最后72℃延伸10 min(PCR 儀：ABIGeneAmp?9700型)。擴增體系為 20 μL，4 μL 5*FastPfu 緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL引物 (5 μmol/L)，0.4 μL FastPfu 聚合酶；10 ng DNA模板。

IlluminaMiseq測序：使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用Axy Prep DNA Gel Extraction Kit(AxygenBiosciences，UnionCity，CA，USA) 進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluor?-ST(Promega，USA)進行檢測定量。根據 IlluminaMiSeq平臺 (Illumina，SanDiego，USA)標準操作規程將純化后的擴增片段構建PE2*300的文庫。

構建文庫步驟：1) 連接“Y”字形接頭；2) 使用磁珠篩選去除接頭自連片段；3) 利用PCR擴增進行文庫模板的富集；4) 氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段。

利用Illumina公司的MiseqPE300平臺進行測序(上海美吉生物醫藥科技有限公司)。原始數據上傳至NCBI數據庫中比對。

2 結果與分析

2.1 感病與非感病植株根際土壤生物學性狀特征比較

由表2可知，RSD感病株根際土壤中涉及土壤碳、氮、磷循環相關酶 (β-葡糖苷酶、氨肽酶、磷酸酶) 的活性均顯著低于非感病株。其中，非感病株根際土壤中β-葡糖苷酶、氨肽酶和磷酸酶活性分別為RSD感病株的2.67倍、1.44倍和4.17倍。另一方面，非感病株根際土壤中微生物生物量碳、氮、磷的變化表現出與土壤酶活性變化一致的趨勢，同樣顯著高于RSD感病株，其數值分別是對應感病株的1.37、1.96和5.08倍。這一結果表明甘蔗根際土壤肥力下降、根際微環境質量劣化可能是導致甘蔗抗性下降、感染RSD的原因之一。

2.2 感病與非感病植株根際土壤細菌群落的豐富度和多樣性

基于云分析平臺，計算出各個樣品的豐富度和多樣性指數，選取Chao1指數指示細菌豐富度，Shannon 和Simpson指數指示細菌多樣性。Chao1、Shannon 指數越大，Simpson指數越小，說明樣品的物種豐富度和多樣性越高[18]。

由表3可知，未感病植株根際土壤中細菌的豐富度Chao1指數和多樣性Shannon指數均顯著高于宿根矮化病感病植株，細菌多樣性Simpson指數顯著低于感病植株。表明甘蔗RSD感病株根際土壤中細菌豐富度和多樣性均顯著低于未感病植株。

2.3 感病與非感病植株根際土壤細菌門分類水平組成

RSD感病株和非感病株根際土壤中分離出的優勢細菌門有11個，各個細菌門在總細菌門群落中的占比見圖1。RSD感病株和未感病株根際土壤中細菌的優勢細菌門類及占比分別為：Proteobacteria (變形桿菌門) 16.36%和33.99%，Chloroflexi (綠彎菌門)33.90%和13.87%，Actinobacteria (放線菌門)14.88%和34.05%，Acidobacteria(酸桿菌門)15.39%和5.96%，Firmicutes (厚壁菌門) 5.79%和2.31%，Gemmatimonadetes (芽單胞菌門)1.88%和3.45%，Nitrospirae (硝化螺旋菌門) 1.40%和3.21%，Cyanobacteria (藍細菌門) 3.18%和0.75%，Planctomycetes(浮霉菌門) 2.63%和0.06%，Bacteroidetes (擬桿菌門)1.48%和0.07%。由上述分析結果可知，甘蔗感染宿根矮化病后，其根際土壤細菌占比呈倍數降低的優勢門類主要有Proteobacteria (變形桿菌門)、Actinobacteria (放線菌門)、Gemmatimonadetes (芽單胞菌門)和Nitrospirae (硝化螺旋菌門)；而占比呈倍數增加的優勢菌門主要有Chloroflexi (綠彎菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Firmicutes (厚壁菌門)、Cyanobacteria (藍細菌門)、Planctomycetes (浮霉菌門)和Bacteroidetes (擬桿菌門)。RSD感病株根際土壤中優勢細菌門占比發生變化，使甘蔗未感病植株根際土壤微生物群落中存在的拮抗關系平衡遭到破壞，可能是導致甘蔗植株抗性減弱，從而感染RSD的主要原因。

表1 測序區域與引物序列名稱Table 1 The name of sequence type and primer sequence

表2 RSD感病株和未感病株根際土壤酶活性及微生物生物量的比較Table 2 Comparison of soil enzyme activities and microbial biomass in rhizosphere soil between RSD infected and non-infected sugarcanes

表3 RSD感病株和非感病株根際土壤細菌多樣性指數Table 3 Diversity index of bacteria in rhizosphere soils of RSD infected and non-infected sugarcanes

2.4 感病株與非感病植株根際土壤細菌屬分類水平組成

在屬分類水平發現，RSD感病植株和非感病植株根際土壤中的優勢菌群 (圖2)有：JG37-AG-4、Xanthobacteraceae(黃色桿菌屬)、Acidothermus、JG30-KF-AS9、Acidobacteria(嗜酸菌屬)、Gaiellales、Roseiflexus(玫瑰菌屬)、Micromonosporaceae(小單孢菌屬)、Nitrospira(硝化螺旋菌屬)、Acidobacteriaceae_Subgroup。其中，RSD感病株根際土壤中細菌優勢菌屬及其占比分別為JG37-AG-4(13.56%)、Xanthobacteraceae(黃色桿菌屬 1.13%)、Acidothermus(2.95%)、JG30-KF-AS9(5.97%)、Acidobacteria(嗜酸菌屬 4.63%)、Gaiellales(1.11%)、Roseiflexus(玫瑰菌屬 1.37%)、Micromonosporaceae(小單孢菌屬1.17%)、Nitrospira(硝化螺旋菌屬 1.40%)、Acidobacteriaceae_Subgroup(3.88%)。RSD非感病株根際土壤中細菌優勢菌屬主要有JG37-AG-4(4.49%)、Xanthobacteraceae(黃色桿菌屬 10.55%)、Acidothermus(5.96%)、JG30-KF-AS9(1.35%)、Acidobacteria(嗜酸菌屬 1.11%)、Gaiellales(4.50%)、Roseiflexus(玫瑰菌屬 3.50%)、Micromonosporaceae(小單孢菌屬 3.50%)、Nitrospira(硝化螺旋菌屬3.20%)、Acidobacteriaceae_Subgroup(0.35%)。

圖1 RSD感病株和非感病株根際土壤細菌門分類水平組成Fig.1 Bacterial community composition in rhizosphere soil of RSD infected and non-infected sugarcanes at the phylum level

圖2 宿根矮化病感病和非感病植株根際土壤細菌屬分類水平組成Fig.2 Bacterial community structure in rhizosphere soil of RSD infected and non-infected sugarcanes at the genus level

同樣地，RSD感病植株根際土壤中優勢細菌屬占比發生顯著變化。與非感病植株相比，RSD感病植株根際土壤中Xanthobacteraceae(黃色桿菌屬)、Acidothermus、Gaiellales、Roseiflexus(玫瑰菌屬)、Micromonosporaceae(小單孢菌屬) 和Nitrospira(硝化螺旋菌屬) 等優勢細菌屬占比呈倍數降低；但Acidobacteria(嗜酸菌屬) 細菌及部分未知菌屬占比呈倍數提高。RSD感病植株根際土壤中優勢細菌在屬分類水平上表現出與門分類水平相同的變化趨勢。由此推測，甘蔗根際土壤中優勢細菌群落結構變化可能是導致甘蔗植株抗性減弱，從而導致感染RSD的重要原因。

3 討論

土壤微生物與植物在根際微環境中進行著復雜頻繁的互作[19-20]。根際微生物與植物之間有著密切的關系，對植物生長具有十分重要的作用，同時對植物生產力以及農業生態系統功能都有著顯著的作用[21]。

研究表明，土壤微生物活性及群落結構變化可敏感地反映土壤生態系統的質量和健康狀況[22]。而土壤酶參與土壤中幾乎所有的有機物質和營養元素的循環[23]，其活性大小不僅能指示土壤生態系統功能變化的多樣性和穩定性[24]，亦是評價土壤健康和肥力水平的重要指標[25]。本試驗結果發現，RSD感病株根際土壤中β-葡糖苷酶、氨肽酶、磷酸酶活性顯著低于非感病株，這一現象不僅表明RSD感病株根際土壤肥力下降、質量劣化，而且也說明設法提高甘蔗根際土壤肥力、維護根際土壤微環境的健康狀況，可能有助于防控甘蔗RSD的發生與蔓延。另外，土壤微生物生物量同樣是衡量土壤質量、維持土壤肥力和作物生產力的一個重要指標[26]。本試驗中RSD感病株根際土壤微生物生物量碳、氮、磷呈現出與土壤酶活性一致的變化趨勢，同樣顯著地低于相應的非感病株根際土壤。這表明甘蔗RSD的發生與根際土壤肥力下降、質量劣質化緊密相關。

利用高通量研究技術，分析RSD感病植株與非感病植株根際土壤微生物群落結構，發現RSD感病植株根際土壤中細菌多樣性指數、豐富度指數均顯著低于非感病植株。楊尚東等[20]曾發現，番茄青枯病感病植株與非感病植株相比，根際細菌多樣性亦不同程度地降低。由此推測，甘蔗RSD、番茄青枯病等病害的發生與蔓延可能與作物根際土壤細菌多樣性下降密切相關。此外，基于門 (phylum) 分類水平發現，與非感病植株相比，RSD感病植株根際土壤中優勢細菌門類占比發生顯著變化。其中，Proteobacteria (變形桿菌門)、Actinobacteria (放線菌門)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)和Nitrospirae(硝化螺旋菌門) 等優勢門類細菌占比呈倍數降低，與之相反，Chloroflexi (綠彎菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Firmicutes (厚壁菌門)、Cyanobacteria (藍細菌門)、Planctomycetes (浮霉菌門)、Bacteroidetes (擬桿菌門) 等優勢門類細菌占比呈倍數增加；屬分類水平，RSD感病植株根際土壤中Xanthobacteraceae(黃色桿菌屬)、Acidothermus、Gaiellales、Roseiflexus(玫瑰菌屬)、Micromonosporaceae(小單孢菌屬) 和Nitrospira(硝化螺旋菌屬) 細菌占比呈倍數降低，但Acidobacteria(嗜酸菌屬) 細菌及部分未知菌屬呈倍數提高。RSD感病植株根際土壤中優勢細菌無論在門分類水平上，還是屬分類水平上均表現出類似的變化趨勢，即：優勢菌門或菌屬的占比雖然有部分提高，但亦有部分優勢菌門或菌屬降低，非感病植株根際土壤中更為多樣的細菌，以及更為豐富和均勻的優勢細菌屬可能是其沒有感病的重要原因。

與甘蔗RSD非感病植株相比，感病植株根際土壤微環境不僅呈現肥力下降，細菌多樣性和豐富度的下降趨勢，而且不同分類水平上，優勢細菌群落結構出現門、屬分類水平上的劇變，鑒于此，研究如何構建穩定的甘蔗根際土壤微環境，提高或維護甘蔗根際土壤肥力及微生物多樣性豐富的根際微環境，會有助于生態防控RSD的發生與蔓延。

4 結論

甘蔗RSD感病植株根際土壤中指示土壤肥力狀況的生物學指標包括酶活性和微生物生物量碳、氮、磷顯著降低，細菌豐富度和多樣性指數顯著下降。

從門分類水平比較，RSD感病植株根際土壤中Proteobacteria (變形桿菌門)、Actinobacteria (放線菌門)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)、Nitrospirae(硝化螺旋菌門) 等優勢門類細菌占比呈倍級降低，而Chloroflexi (綠彎菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Firmicutes (厚壁菌門)、Cyanobacteria (藍細菌門)、Planctomycetes (浮霉菌門)、Bacteroidetes (擬桿菌門) 等優勢門類細菌占比呈倍級增加。從屬分類水平比較，RSD感病植株根際土壤中Xanthobacteraceae(黃色桿菌屬)、Acidothermus、Gaiellales、Roseiflexus(玫瑰菌屬)、Micromonosporaceae(小單孢菌屬) 和Nitrospira(硝化螺旋菌屬) 細菌占比呈倍級降低，而Acidobacteria(嗜酸菌屬) 細菌及部分未知菌屬卻呈倍級提高。

致謝：感謝廣西農業科學院甘蔗研究所覃振強博士和張小秋博士在甘蔗根際土壤樣品采集以及甘蔗植株宿根矮化病株的鑒定方面給予的幫助。