黃瓜連作土壤高溫處理對(duì)根結(jié)線蟲和枯萎病的影響

張廣旭，呂亭輝?，周 娣，鄭世偉，姚夢(mèng)蝶，余朝閣*，李天來*

（1 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/設(shè)施園藝省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/北方園藝設(shè)施設(shè)計(jì)與應(yīng)用技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心；2 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)圖書館，沈陽 110161）

黃瓜是設(shè)施生產(chǎn)重要果菜，全國(guó)設(shè)施栽培面積千萬畝以上[1]，占設(shè)施蔬菜總面積近20%。隨著設(shè)施蔬菜生產(chǎn)專業(yè)化和規(guī)?；厔?shì)的發(fā)展，必然要求設(shè)施黃瓜主產(chǎn)區(qū)在同一塊土地連續(xù)多年種植黃瓜，而黃瓜是易于發(fā)生連作障礙的蔬菜作物，因而連作障礙已成為制約設(shè)施黃瓜生產(chǎn)的重要因素[2-3]。引起連作障礙的原因有多種，但最主要的原因還是土壤中病原物積累而導(dǎo)致的土傳病害加重[3-4]。而在黃瓜與眾多連作相關(guān)的病害中，根結(jié)線蟲和枯萎病發(fā)生尤為普遍且嚴(yán)重[5-8]。

當(dāng)前防治連作病害方法有嫁接、藥劑灌根和土壤消毒等措施，上述措施均可不同程度減輕連作障礙，但是單一使用其中一種措施均存在明顯的不足之處。如嫁接在設(shè)施黃瓜栽培中基本普及，但嫁接一定程度上影響了產(chǎn)品的品質(zhì)。藥劑灌根主要是對(duì)未發(fā)病植株起著保護(hù)作用，對(duì)已發(fā)病植株治愈效果通常并不明顯，而且極易導(dǎo)致農(nóng)藥殘留。土壤消毒措施主要在黃瓜定植前應(yīng)用，又可分為生物、化學(xué)和物理消毒方法。前兩種主要是應(yīng)用生物農(nóng)藥或化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行土壤處理，通過抑菌或殺菌起著防病作用，但往往存在生物消毒效果一般、化學(xué)消毒農(nóng)藥殘留超標(biāo)等問題；物理消毒主要是利用溫室7、8月份溫室休閑期高溫悶棚，該法不僅無任何農(nóng)藥殘留、還可促進(jìn)土壤礦質(zhì)元素轉(zhuǎn)化，但是悶棚溫度指標(biāo)尚不清楚。

本研究首先探明根結(jié)線蟲和枯萎病的發(fā)生程度及二者病原物的數(shù)量與黃瓜連作茬次之間的關(guān)系；然后對(duì)發(fā)病嚴(yán)重的連作土壤高溫處理，并用處理過的土壤栽培黃瓜，調(diào)查不同溫度處理的病害發(fā)生程度、土壤病原物數(shù)量及植株生長(zhǎng)情況。旨在為溫室高溫消毒防治連作病害提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

‘津優(yōu)30’黃瓜連作土壤于2016年2月黃瓜拉秧后取自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院科研基地20號(hào)日光溫室。該溫室跨度8 m、長(zhǎng)度60 m，于2006年8月至2015年期間，每年8月由溫室東端向西依次挖3個(gè)南北走向栽培槽，長(zhǎng)7.0 m、寬0.65 m、深0.30 m，兩槽間距0.75 m，槽內(nèi)鋪料薄膜與溫室土壤隔離，從溫室外同一塊地取30 cm深表層土，通過添加肥料將其調(diào)配為含有機(jī)質(zhì)2.30%、全磷1.61 g/kg、全鉀10.6 g/kg、堿解氮102 mg/kg、速效磷41.3 mg/kg、速效鉀223 mg/kg，混拌均勻后填平栽培槽，每年9月和翌年3月，分別進(jìn)行秋冬茬和春茬黃瓜栽培 (品種均為‘津優(yōu)30’)，毎槽定植2行，株距35 cm、行距50 cm。2015年9月至2016年2月(秋冬茬)，該溫室黃瓜連作的茬口有1、3、5、7、9、11、13、17、19茬，每個(gè)茬次有3個(gè)栽培槽 (即3 次重復(fù))。

1.2 連作黃瓜根結(jié)線蟲和枯萎病調(diào)查與土壤病原物數(shù)量測(cè)定

1.2.1 根結(jié)線蟲和枯萎病田間調(diào)查 2016年2月于2015年秋冬茬黃瓜生產(chǎn)結(jié)束時(shí)，調(diào)查不同連作茬次黃瓜的根結(jié)線蟲和枯萎病發(fā)生情況。由于調(diào)查的黃瓜植株整體上根結(jié)線蟲發(fā)病重，且不同病株間嚴(yán)重度不一致；而枯萎病整體上發(fā)病較輕，各病株病害級(jí)別幾乎全部為1級(jí)。所以在調(diào)查根結(jié)線蟲時(shí)，記錄不同植株發(fā)病嚴(yán)重度級(jí)別，病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照李洪連等方法[9]，然后計(jì)算病情指數(shù)表示發(fā)病程度；而枯萎病則直接統(tǒng)計(jì)發(fā)病植株占調(diào)查全部植株數(shù)量的百分率，用發(fā)病率表示發(fā)病程度。調(diào)查方法為栽培槽東側(cè)行由北向南調(diào)查第3、6、9、12、15株，西側(cè)行由南向北調(diào)查第3、6、9、12、15株。每處理調(diào)查10株，3次重復(fù)。

1.2.2 土壤中根結(jié)線蟲和枯萎病菌數(shù)量測(cè)定 上述黃瓜拉秧后，采集不同連作茬次的土壤，采樣方法為從距栽培槽南端約1.2、2.4、3.6、4.8、6.0 m的槽中部取土，取土范圍的長(zhǎng)度和寬度20 cm左右、深度30 cm左右，將所取土樣混合均勻，及時(shí)分離檢測(cè)根結(jié)線蟲和鐮刀菌數(shù)量。根結(jié)線蟲分離采用淘洗過篩蔗糖密度梯度離心法[10]，然后在顯微鏡觀測(cè)幼蟲及成蟲總數(shù)；尖孢鐮刀菌分離計(jì)數(shù)采用稀釋涂布平板法[11]，培養(yǎng)3～4 d后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并鑒定病菌類型。經(jīng)沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)線蟲研究室和本實(shí)驗(yàn)室鑒定，本連作土壤中根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲 (Meloidogyne incognita)，枯萎病菌為尖孢鐮刀菌黃瓜?；?Fusarium oxysporumf.spcucumarinumOwen)。

1.3 高溫處理連作土壤對(duì)病害和病原物的影響

1.3.1 連作土壤高溫處理與黃瓜秧苗培育 取發(fā)病較重的第17茬黃瓜連作的土壤，取樣點(diǎn)及方法同1.2.2，每槽所取土樣充分混勻后均分5份，分別放在高壓滅菌鍋中進(jìn)行45℃、50℃、55℃、60℃的溫度處理2 h (上述溫度下滅菌鍋內(nèi)氣壓仍為常壓)，以未經(jīng)溫度處理的連作土壤為對(duì)照。

1.3.2 高溫處理對(duì)土壤病原物和黃瓜病害的影響取上述經(jīng)45℃、50℃、55℃和60℃處理的和未經(jīng)高溫處理 (CK) 的土壤，測(cè)定不同處理土壤中根結(jié)線蟲 (M.incognita) 和鐮刀菌 (F.oxysporumf.spcucumarinum) 數(shù)量，測(cè)定方法參照本文1.2.2。每處理5個(gè)樣品，重復(fù)3次。

將上述經(jīng)不同溫度處理的土壤和對(duì)照土壤分別裝于直徑12 cm、高12 cm的塑料缽中，每缽裝土保持壓實(shí)后10 cm高度，以備定植黃瓜秧苗。黃瓜用沈陽農(nóng)業(yè)大大學(xué)蔬菜無土育苗營(yíng)養(yǎng)基質(zhì) (專利號(hào)ZL03133591.8)于50孔穴盤中育苗，待秧苗長(zhǎng)至一葉一心期，選取生長(zhǎng)整齊一致的秧苗分別定植于上述裝有不同處理土壤的塑料缽中。定植后置于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院科研基地29號(hào)溫室 (育苗溫室)，晝溫25℃～32℃、夜溫18℃～20℃，空氣濕度白天80%、夜間90%的條件下培養(yǎng)25 d，然后調(diào)查根結(jié)線蟲和枯萎病發(fā)病情況，病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及病情指數(shù)計(jì)算公式參照李洪連等[9]的方法。

1.3.3 土壤高溫處理對(duì)黃瓜植株生長(zhǎng)的影響 育苗及定植同上，定植后21 d測(cè)量各處理土壤栽培的黃瓜秧苗株高、莖粗、全株鮮重、地下及地上部分干重，并計(jì)算全株干重和病情指數(shù)。壯苗指數(shù)計(jì)算公式：壯苗指數(shù)＝ (莖粗/株高 + 根干重/地上部干重) ×全株干重。上述病害調(diào)查和生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定均為每處理10株，設(shè)3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel進(jìn)行基本統(tǒng)計(jì)，然后采用SPSS19軟件鄧肯法進(jìn)行差異顯著性分析 (均為P＜0.05水平) 和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜連作對(duì)土傳病害與土壤病原物數(shù)量的影響

2.1.1 連作對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲和枯萎病發(fā)生的影響圖1表明，黃瓜根結(jié)線蟲病情指數(shù)和枯萎病發(fā)病率均隨連作茬次的增加而升高。其中根結(jié)線蟲病情指數(shù)于黃瓜連作第1～5茬緩慢升高，但是在連作5茬以內(nèi)各茬病情指數(shù)之間差異未達(dá)到顯著水平；連作第7茬以后根結(jié)線蟲病情指數(shù)開始迅速升高，并于第17茬達(dá)到發(fā)病高峰，病情指數(shù)為60.0，然后略有下降；黃瓜連作第13～19茬期間，根結(jié)線蟲病情指數(shù)均處于較高水平，且各茬黃瓜病情指數(shù)之間均無顯著差異 (圖1A)。而枯萎病發(fā)病率于連作第3茬時(shí)無顯著變化，第5茬開始迅速升高，并于第13茬達(dá)到發(fā)病高峰，發(fā)病率為46.76%，然后發(fā)病率緩慢下降；17茬與19茬的發(fā)病率略低于13茬，但未達(dá)到顯著水平。黃瓜連作第11～19茬期間，枯萎病發(fā)病率保持在較高水平，各茬黃瓜發(fā)病率之間也沒有顯著差異 (圖1B)。上述結(jié)果說明，兩種病害均隨黃瓜連作茬次增加而加重，并于第13～17茬發(fā)病程度最重。2.1.2 黃瓜連作對(duì)土壤中病原物數(shù)量的影響 圖2表明，土壤中根結(jié)線蟲 (M.incognita) 和尖孢鐮刀菌(F.oxysporumf.spcucumarinum) 數(shù)量均隨黃瓜連作茬次的增加而增多。其中根結(jié)線蟲蟲口密度從黃瓜連作第1茬到第13茬緩慢升高，至第17茬迅速升高并達(dá)到最高水平，蟲口密度為每克干土17.6條，第19茬迅速下降，擔(dān)仍保持較高水平 (圖2A)。而尖孢鐮刀菌數(shù)量于連作第3茬時(shí)即迅速升高，并于第13茬達(dá)到最高水平，然后緩慢下降；黃瓜連作第11～19茬期間，土壤中鐮刀菌數(shù)量始終保持高水平穩(wěn)定，每克干土中病菌孢子數(shù)4.4 × 104～5.0 × 104cfu/g/，且各茬黃瓜連作土壤之間病菌孢子數(shù)無顯著差異 (圖2B)。上述結(jié)果表明，黃瓜長(zhǎng)期連作導(dǎo)致土壤中根結(jié)線蟲和鐮刀菌等病原物積累。

圖1 黃瓜根結(jié)線蟲和枯萎病發(fā)生情況隨連作年限的變化Fig.1 Change of disease incidence of root knot-nematode and Fusarium wilt with continuous crop’s numbers

2.1.3 連作黃瓜發(fā)病程度與土壤中病原物數(shù)量的關(guān)系比較圖1和圖2可見，不同連作茬次黃瓜的根結(jié)線蟲和枯萎病發(fā)生程度，與其栽培土壤中相應(yīng)病原物的數(shù)量變化規(guī)律相似，將各茬黃瓜根結(jié)線蟲病情指數(shù)與相應(yīng)茬次土壤中根結(jié)線蟲的蟲口密度、枯萎病發(fā)病率與相應(yīng)茬次土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明其相關(guān)系數(shù)分別為0.947和0.971，均達(dá)到顯著水平，說明這兩種病害隨著黃瓜連作茬次的增加而加重，主要是因?yàn)檫B作導(dǎo)致土壤中病原物積累的結(jié)果。

2.2 高溫處理連作土壤對(duì)土傳病害與病原物的影響

圖2 黃瓜連作土壤中根結(jié)線蟲和枯萎病菌數(shù)量Fig.2 Number ofM.incognitaandF.oxysporumin continuous cucumber cropping soil

圖3 不同溫度處理黃瓜連作土壤根結(jié)線蟲病情指數(shù)和枯萎病發(fā)病率Fig.3 Index of root knot-nematode and incidence of Fusarium wilt in continuous cropping soil treated with different temperatures

2.2.1 高溫處理土壤對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲和枯萎病發(fā)生的影響 取根結(jié)線蟲和枯萎病發(fā)生均嚴(yán)重的第17茬黃瓜連作土壤，對(duì)其分別進(jìn)行45℃、50℃、55℃、和60℃的溫度處理 (圖3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，45℃溫度處理黃瓜連作土壤，處理與對(duì)照之間對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲病情指數(shù)均為13.3，50℃至60℃的溫度處理黃瓜連作土壤2 h，各處理黃瓜根結(jié)線蟲病情指數(shù)均為0(圖3A)，說明45℃的溫度處理土壤不能抑制黃瓜根結(jié)線蟲的發(fā)生，而50℃以上的溫度處理則可以完全抑制黃瓜根結(jié)線蟲的發(fā)生；45℃至60℃的溫度范圍處理黃瓜連作土壤，各處理黃瓜枯萎病發(fā)病率均顯著低于對(duì)照，且隨著處理溫度的升高而顯著降低，其中60℃的溫度處理，黃瓜枯萎病發(fā)病率降至0%(圖3B)，說明45℃以上的溫度處理土壤，隨著處理溫度的升高對(duì)枯萎病抑制效果也越明顯，處理溫度達(dá)到60℃時(shí)，則可以完全抑制枯萎病的發(fā)生。

2.2.2 高溫處理對(duì)土壤中根結(jié)線蟲和尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響 圖4A顯示，黃瓜連作土壤中根結(jié)線蟲的蟲口密度，在45℃至55℃的溫度范圍內(nèi)隨著處理溫度的升高而顯著降低，當(dāng)溫度升至55℃以上時(shí)，根結(jié)線蟲蟲口密度降至0，說明45℃以上的溫度處理可減少土壤中根結(jié)線蟲數(shù)量，而當(dāng)對(duì)土壤處理的溫度達(dá)到55℃以上時(shí)，可完全殺滅其中的根結(jié)線蟲；土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量在45℃至60℃的溫度范圍內(nèi)也隨著處理溫度的升高而顯著降低，當(dāng)處理溫度升至60℃時(shí)，鐮刀菌數(shù)量降為0 (圖4B)，說明45℃以上的溫度處理也減少土壤枯萎病菌數(shù)量，而且處理溫度越高，殺菌效果越好，當(dāng)處理溫度達(dá)到60℃以上時(shí)可完全殺滅土壤中枯萎病菌。

2.3 高溫處理連作土壤對(duì)黃瓜植株生長(zhǎng)的影響

圖4 不同溫度處理的黃瓜連作土壤中根結(jié)線蟲和枯萎病菌數(shù)量Fig.4 Number ofM.incognitaandF.oxysporumin continuous cucumber cropping soil treated with different temperatures

表1 不同溫度處理連作土壤對(duì)黃瓜生長(zhǎng)指標(biāo)的影響Table 1 Growth parameters of cucumber in continuous cropping soil treated with different temperatures

由表1可見，用45℃、50℃和55℃處理的連作土壤定植黃瓜秧苗，植株的株高、莖粗、鮮重、干重以及壯苗指數(shù)等生長(zhǎng)指標(biāo)與對(duì)照之間均無顯著差異；用60℃的溫度處理的連作土壤定植黃瓜秧苗，植株上述生長(zhǎng)指標(biāo)均高于對(duì)照，而且除莖粗以外，株高、鮮重、干重及壯苗指數(shù)等生長(zhǎng)指標(biāo)與對(duì)照之間差異均達(dá)到顯著水平。上述結(jié)果說明，用60℃處理2 h的連作土壤定植黃瓜秧苗，不僅顯著促進(jìn)秧苗生長(zhǎng)，還具有顯著的壯苗作用。

3 討論

3.1 黃瓜連作土傳病害和病原物動(dòng)態(tài)變化

在黃瓜連作土壤中，單位質(zhì)量干土中根結(jié)線蟲的蟲口密度和尖孢鐮刀菌的數(shù)量均隨著連作茬次的增加而增加，這一結(jié)果與時(shí)立波等[12]關(guān)于番茄種植年限與土壤中根結(jié)線蟲蟲口密度間關(guān)系及趙青云等[13]關(guān)于香草蘭種植年限與土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量之間關(guān)系的研究結(jié)果一致。同時(shí)，該兩種病原物所致病害的病情指數(shù)與其在土壤中積累的數(shù)量呈相同變化趨勢(shì)。相關(guān)性分析表明，兩種病害的病情指數(shù)與土壤中相應(yīng)病原物的數(shù)量均呈顯著正相關(guān)。說明黃瓜連作病害加重，主要是由土壤中病原物積累造成的。兩種病害及其病原物數(shù)量在黃瓜連作17茬時(shí)達(dá)較高水平，之后則有下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)殡S著連作茬次的增加，土壤中根結(jié)線蟲和枯萎病菌的拮抗微生物也隨著此兩種病原物的積累而積累，當(dāng)拮抗微生物積累到一定數(shù)量時(shí)，必然抑制根結(jié)線蟲和枯萎病菌的繁殖；另外，土壤中化感物質(zhì)也隨著連作茬次增加而積累，當(dāng)積累到一定數(shù)量時(shí)也會(huì)對(duì)病原物產(chǎn)生抑制作用，上述抑制病原物的因素均可能影響連作病害的發(fā)生。關(guān)于連作病害達(dá)到最高水平后的進(jìn)一步變化規(guī)律及其深層機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

3.2 根結(jié)線蟲與枯萎病之間的相互關(guān)系

關(guān)于植物根結(jié)線蟲與枯萎病之間的相互關(guān)系研究從上世紀(jì)八十年代以來偶有報(bào)道，多數(shù)研究認(rèn)為，土壤中根結(jié)線蟲促進(jìn)植物枯萎病的發(fā)生[14-15],而馬冉等研究則發(fā)現(xiàn)，預(yù)先接種南方根結(jié)線蟲能顯著減輕香蕉枯萎病的發(fā)病程度，但同時(shí)接種2種病原物或先接種枯萎病菌后再接種南方根結(jié)線蟲，則加重香蕉枯萎病的發(fā)生[16]。本研究中，兩種病害均隨著連作茬次的增加而加重，土壤中其相應(yīng)的病原物也隨連作茬次的增加而積累，這與前人研究結(jié)果一致；但在病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，各茬黃瓜根結(jié)線蟲明顯比枯萎病發(fā)病程度嚴(yán)重，也存在不少黃瓜植株單獨(dú)發(fā)生根結(jié)線蟲或枯萎病的情況。因此，此兩種病害發(fā)生的相互作用關(guān)系尚需深入探究。

3.3 土壤高溫處理對(duì)土傳病害與病原物的抑制作用

本研究中，45℃處理黃瓜連作土壤顯著降低土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量和枯萎病病情指數(shù)，而王惟萍等[17]研究發(fā)現(xiàn)45℃則可完全殺滅土壤中尖孢鐮刀菌?？赡芤?yàn)楸狙芯刻幚頃r(shí)間僅為2 h，而后者處理時(shí)間最短就為1 d (24 h)。對(duì)黃瓜連作土壤進(jìn)行50℃～60℃的處理，均顯著降低其中的根結(jié)線蟲和枯萎病菌的數(shù)量，并抑制后期兩種病害的發(fā)生程度，且隨著處理溫度的升高，殺菌和防病的效果也越明顯；55℃時(shí)可完全殺滅土壤中根結(jié)線蟲，達(dá)60℃時(shí)可同時(shí)殺滅枯萎病菌，上述處理一旦殺滅了土壤病原物，即可完全控制相應(yīng)病害的發(fā)生。以上研究結(jié)果對(duì)設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中溫室高溫消毒技術(shù)具有重要的指導(dǎo)意義，設(shè)施生產(chǎn)在夏季溫室休閑期將溫室土壤翻耕，利用此時(shí)太陽光照強(qiáng)、氣溫高的特點(diǎn)對(duì)溫室進(jìn)行高溫悶棚，使耕層土溫達(dá)55℃以上，必然對(duì)后期栽培具有重要的防病作用。

3.4 土壤高溫處理對(duì)黃瓜植株生長(zhǎng)的影響

用60℃處理的連作土壤定植黃瓜，后期植株生長(zhǎng)指標(biāo)和壯苗指數(shù)也顯著優(yōu)于對(duì)照。張子龍等研究發(fā)現(xiàn)，用經(jīng)過高溫滅菌的連作土壤栽培植物，植株的株高、莖粗等生長(zhǎng)指標(biāo)均顯著高于未進(jìn)行高溫處理土壤的相應(yīng)指標(biāo)，根系形態(tài)也明顯改善，根長(zhǎng)和根系活力增加[18]。導(dǎo)致連作障礙的原因除與病原物積累有關(guān)外，還與土壤中作物根系分泌的自毒物質(zhì)等因素有關(guān)，自毒物質(zhì)不僅刺激病菌生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，還對(duì)植物生長(zhǎng)具一定的抑制作用[19-20]。本研究中用于60℃高溫處理的連作土壤栽培黃瓜，植株生長(zhǎng)狀況明顯改善，可能是因?yàn)榻?jīng)60℃高溫處理后，抑制或鈍化了連作土壤中的自毒物質(zhì)、或者改變了土壤中養(yǎng)分狀態(tài) (如從不可吸收狀態(tài)轉(zhuǎn)化為可吸收狀態(tài))，其具體原因及機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

黃瓜連作導(dǎo)致土壤中根結(jié)線蟲和枯萎病菌數(shù)量積累，進(jìn)而導(dǎo)致兩種病害加重。用55℃以上的高溫處理連作土壤不僅能夠減少土壤中根結(jié)線蟲和枯萎病菌的數(shù)量，而且能抑制甚至避免這兩種病害的發(fā)生，并具有促進(jìn)黃瓜植株生長(zhǎng)和壯苗作用。