不同提取方法對煙草纖維素微觀結構的影響

楊莫愁，周 順，張曉宇，楊 俊，王孝峰，田振峰，葛少林，王婉婉，劉 非，徐迎波*，孔 俊，何 慶

1.中國科學技術大學煙草與健康研究中心，合肥市徽州大道1129號 230052

2.安徽中煙工業有限責任公司煙草行業燃燒熱解研究重點實驗室，合肥市高新區天達路9號 230088

3.安徽中煙工業有限責任公司煙草化學安徽省重點實驗室，合肥市高新區天達路9號 230088

纖維素是煙草細胞壁的主要成分，是構成煙葉細胞組織和骨架的基本物質，其燃燒行為對煙草整體的燃燒行為有重要影響［1-3］。近年來，纖維素作為煙草中重要大分子物質之一，受到研究人員的廣泛關注。朱曉蘭等［4］采用糖、酸介質處理煙草纖維素，發現纖維素的形態結構發生變化，可及度增大。楊瀅等［5］研究發現，煙草纖維素結構上的差異使其表現出不同的燃燒熱解特性，導致煙草纖維素熱解產物的質量分數產生明顯差異。纖維素的微觀結構主要指晶區和非晶區的結構，是決定纖維素性質的重要因素［6-9］。纖維素的性質非常復雜，會隨植物來源、分離和提純過程以及聚集狀態的變化而產生較大差異［10］。天然煙草纖維主要包含纖維素、半纖維素、木質素、果膠及脂肪、淀粉、蛋白質等成分。關于煙草纖維素的微觀結構研究，在對煙草纖維素微觀結構影響盡量小的前提下進行纖維素提取具有非常重要的現實意義。目前，煙草纖維素分離和提純過程對其微觀結構的影響研究鮮見報道。固體交叉極化/魔角旋轉13C核磁共振（CP/MAS13C NMR）技術是研究高分子化合物化學結構和物理性質的重要工具之一，基于該技術，研究人員不需要對固體粉末組分進行分離和溶解等處理，可通過定量估計其化學組成和化學結構直接獲得可靠的結構信息。因此，結合煙草行業標準方法 YC/T 347—2010［11］及植物纖維素提取中廣泛采用的方法［12］，本研究中采用中性洗滌劑法［11］、酸性洗滌劑法［11］、酸性水解法［13-14］、堿液分離法［15-16］對烤煙和香料煙煙葉樣品中的纖維素進行提取，利用CP/MAS13C NMR技術對4種提取方法所獲纖維素樣品的微觀結構進行對比分析，探究不同提取方法對煙草纖維素微觀結構的影響，旨在為煙草纖維素的提取及微觀結構的研究提供方法參考，并為進一步揭示煙草纖維素微觀結構對其燃燒熱解機制的影響奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

煙葉樣品由安徽中煙工業有限責任公司提供，包括烤煙（2017年，貴州正安，C3F）和香料煙（2016年，云南保山，B二級）。煙葉樣品于烘箱中（40±1）℃干燥2 h，機械粉碎，過425 μm（40目）篩，密封儲存備用。

苯、乙醇、乙醚、丙酮、乙二胺四乙酸二鈉、四硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉、乙二醇乙醚、磷酸氫二鈉、冰醋酸、鹽酸、正辛醇、氫氧化鈉、濃硫酸、亞氯酸鈉（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；耐高溫α-淀粉酶（BR）、十六烷基三甲基溴化銨、亞氯酸鈉（AR）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；水為二次蒸餾水。

AVANCE AV 400超導傅里葉數字化核磁共振譜儀（德國Bruker公司）；HHS11-2型恒溫水浴鍋（上海科升儀器公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；YB-2000A型高速多功能粉碎機（永康市速鋒工貿有限公司）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海右一儀器公司）；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵（鄭州市長城儀器公司）；SL234型電子天平（感量0.000 1 g，美國Denver公司）；SZ-93A自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 煙草纖維素提取

1.2.1.1 試樣脫脂

參考文獻［11］方法進行煙草樣品的脫脂處理。稱取20 g試樣，置于1 000 mL圓底燒瓶中，依次加入苯、乙醇各200 mL和乙醚40 mL；將圓底燒瓶置于水浴鍋中加熱，開啟冷凝水，維持微沸狀態4 h。取燒杯和經過與試樣相同脫脂處理并用丙酮沖洗后的濾紙，置于烘箱中烘干至恒質量，放入干燥器中備用。水浴鍋停止加熱后，將燒瓶靜置冷卻，抽濾，并用丙酮沖洗至濾出液無色。將濾紙和濾渣一起轉移到燒杯中，放入烘箱中在（105±2）℃條件下烘干至恒質量，置于干燥器中備用。

1.2.1.2 中性洗滌劑法提取

采用煙草行業標準 YC/T 347—2010［11］中的中性洗滌方案對烤煙和香料煙煙葉樣品中的纖維素進行初步提取，獲得中性洗滌纖維樣品。參考文獻［17-18］的方法對樣品進行純化：

稱取27 g NaOH，量取75 mL冰醋酸，將二者混合并用蒸餾水稀釋至1 L，得到醋酸緩沖溶液。將抽干后的煙草中性洗滌纖維樣品置于圓底燒瓶中，加入200 mL 1.7%（質量分數）NaClO2溶液，在pH=4.5（加入200 mL醋酸緩沖溶液）、油浴125℃條件下加熱4 h。加熱結束后，抽濾，用蒸餾水清洗3次。將脫除木質素后的樣品置于圓底燒瓶中，在室溫下加入400 mL 2.5 mol/L的HCl溶液，采用油浴加熱至100℃，保持4 h。加熱結束后，抽濾，并用熱水（90～100℃）沖洗管壁和剩余物。抽干后將剩余物放入（105±2）℃烘箱中烘干至恒質量。

1.2.1.3 酸性洗滌劑法提取

采用煙草行業標準 YC/T 347—2010［11］中的酸性洗滌方案對烤煙和香料煙煙葉樣品中的纖維素進行提取，獲得酸性洗滌纖維素樣品。

1.2.1.4 酸性水解法提取

參考文獻［13-14］的方法對煙草樣品中的纖維素進行酸性水解法提取。稱取5.0 g脫脂樣品，置于圓底燒瓶中，加入100 mL蒸餾水和2.2 mL濃硫酸，在90℃下攪拌2 h，以水解半纖維素。加熱結束后，抽濾，用蒸餾水清洗3次。將樣品轉移至圓底燒瓶中，加入200 mL 1.7%（質量分數）NaClO2溶液，在pH=4.5、油浴125℃條件下加熱4 h。加熱結束后，抽濾，用蒸餾水清洗3次，將剩余物放入（105±2）℃烘箱中烘干至恒質量。

1.2.1.5 堿液分離法提取

采用文獻［15-16］的方法對煙草樣品中的纖維素進行堿液分離法提取。稱取5.0 g脫脂樣品，置于圓底燒瓶中，加入100 mL 4%NaOH溶液，在油浴125℃下加熱2 h。加熱結束后，抽濾，用蒸餾水清洗3次。將剩余物轉移至圓底燒瓶中，加入200 mL 1.7%（質量分數）NaClO2溶液，在pH=4.5、油浴125℃條件下加熱4 h。加熱結束后，抽濾，用蒸餾水清洗3次，將剩余物放入（105±2）℃烘箱中烘干至恒質量。

1.2.2 煙草纖維素純度和得率測定

采用 Van Soest法［19］測定中性洗滌劑法、酸性洗滌劑法、酸性水解法、堿液分離法提取所得纖維素純度。稱取0.5 g纖維素樣品（m0），加入100 mL酸性洗滌劑，煮沸并回流1 h。抽濾，用沸水浸泡15～20s后沖洗過濾。加入少量丙酮洗滌殘渣，用蒸餾水反復沖洗至洗滌液中性，將殘渣烘干至恒質量m1（g）。向所得酸性洗滌纖維素中加入25 mL 72%硫酸，攪拌條件下消化3 h，過濾，洗滌至中性，烘干至恒質量m2（g）。

纖維素純度（P）計算如式（1）：

纖維素得率（Y）計算如式（2）：

式中：M為煙葉樣品質量（g）。

1.2.3 煙草纖維素微觀結構表征

利用CP/MAS13C NMR技術對煙草纖維素樣品微觀結構進行分析，測試條件：場強9.4 T，4 mm魔角探頭，轉速15 kHz，脈沖寬度90°，交叉極化時間4 μs，接觸時間2 ms，采樣時間34 ms，采樣間隔時間2.0 s，掃描次數1 024次，譜寬300（10-6），一級定標溶劑（CH3）4Si。運用MestReNova 6.1.1軟件及Peakfit 4.0軟件處理實驗所得光譜，采用波譜去卷積技術對圖譜進行分峰處理，通過峰形擬合計算煙草纖維素樣品晶型及分布、結晶度、原纖尺寸等結構信息［20］。

2 結果與討論

2.1 煙草纖維素的得率及純度

采用中性洗滌劑法、酸性洗滌劑法、酸性水解法、堿液分離法提取烤煙和香料煙煙葉樣品的纖維素，纖維素純度與得率見表1。可以看出，采用酸性水解法提取所得的烤煙煙葉纖維素的得率最高，為12.1%，與文獻［21］報道的烤煙煙葉纖維素含量分布具有一致性。采用4種提取方法獲得的烤煙煙葉纖維素樣品的純度大小順序為：中性洗滌劑法（81.2%）＞酸性水解法（78.6%）＞堿液分離法（74.4%）＞酸性洗滌劑法（53.1%）。香料煙煙葉纖維素的得率和純度結果與烤煙煙葉一致。

就中性洗滌劑法而言，煙葉經中性洗滌劑處理后得到中性洗滌纖維，采用NaClO2和HCl溶液分別脫除中性洗滌纖維中的木質素和半纖維素，即獲得纖維素樣品。采用該方法所得纖維素樣品中纖維素的純度較高，但是為了去除殘留的洗滌劑，需要多次洗滌樣品，因此纖維素得率較低。

對于酸性洗滌劑法來說，煙葉樣品經過酸性洗滌劑處理，蛋白質、糖類、脂類及部分半纖維素被脫除，但仍存在木質素及少量半纖維素雜質，因此采用該方法所得纖維素樣品的純度最低。由于該方法亦需多次洗滌樣品以去除殘留的洗滌劑，因此纖維素得率較低。

堿液分離法是基于NaOH溶液可以削弱纖維素和半纖維素之間的氫鍵及半纖維素和其他組分內部分子之間酯鍵的皂化作用［22］，使木質素和半纖維素溶于NaOH溶液的一種纖維素提取方法。煙葉經NaOH溶液處理后再用NaClO2溶液脫除其中殘留的木質素即可獲得纖維素樣品。由于纖維素提取過程中部分纖維素會與NaOH溶液反應而消解［23］，因此堿液分離法的得率較低。

酸性水解法采用稀硫酸溶液處理煙葉樣品，在稀酸溶液中，木質素可降解為多種單環芳香族化合物，半纖維素也可降解為多糖或醛酸，但纖維素不會發生溶解。在利用NaClO2溶液脫除木質素后，即可實現纖維素和木質素、半纖維素的分離。此外，酸性溶液能夠增大纖維素的可及度［22］，因此酸性水解法的纖維素得率最高。采用該方法所得纖維素的純度居于中性洗滌劑法與堿液分離法之間。

表1 4種提取方法所獲煙草纖維素的純度和得率Tab.1 Purity and yield of tobacco cellulose obtained by four extraction methods

2.2 煙草纖維素的CP/MAS13C NMR光譜

采用中性洗滌劑法、酸性洗滌劑法、酸性水解法和堿液分離法等4種方法提取所得烤煙和香料煙煙葉纖維素樣品，并對其進行CP/MAS13C NMR分析，結果如圖1和表2所示。可以看出，煙草纖維素的13C NMR吸收信號峰主要在δ60～110之間。其中，δ95～110處的吸收峰歸屬于C-1，表征晶態結構，通過對其擬合可得到纖維素晶型及比例；δ80～90處的吸收峰歸屬于C-4，表征纖維素的結晶區和無定形區，常用于研究纖維素結晶區內和無定形區內纖維素分子的排列情況，通過擬合及計算可獲得結晶度和原纖尺寸等結構信息；δ60～68和68～80處的吸收峰分別歸屬于C-6和吡喃環上的其他C（C-2,3,5）。

圖1 煙草纖維素樣品的CP/MAS13C NMR光譜圖Fig.1 CP/MAS13C NMR spectra of tobacco cellulose samples

表2 煙草纖維素樣品CP/MAS13C NMR光譜的化學位移Tab.2 CP/MAS13C NMR chemical shifts for tobacco cellulose samples

2.3 煙草纖維素的晶型及分布

纖維素在固態下存在著5種結晶變體，天然纖維素的結晶格子被稱為纖維素I。纖維素I是纖維素 Iα和纖維素 Iβ兩種晶體的混合物［24］，二者比例隨著原料種類及處理方式的不同而變化。在一定條件下，纖維素I可以轉化為次晶或無定形纖維素［8,25］。

圖2 中性洗滌劑法烤煙纖維素樣品的CP/MAS13C NMR光譜C-1信號峰擬合結果Fig.2 Fitting result of C-1 signal peak of13C CP/MAS NMR spectra of flue-cured tobacco cellulose extracted by neutral detergent method

根據 Larsson等提出的概念［26-27］，利用 4個Lorentzian線形表示不同的晶型，并利用Peakfit 4.0軟件對C-1信號峰進行擬合。圖2為采用中性洗滌劑法提取所得的烤煙煙葉纖維素樣品的核磁共振光譜C-1信號峰擬合結果。纖維素Iα在δ104.8處顯示1個單一的共振峰；纖維素Iβ顯示1個雙峰（δ105.4和δ103.5處）；δ104.2處的單一信號峰歸屬于次晶，其表示有序性不及但運動性大于纖維素 Iα和 Iβ的結晶結構。

根據不同纖維素樣品C-1信號峰擬合峰的相對信號強度計算纖維素樣品的晶型比例，結果如表3所示。由表3可知，烤煙和香料煙煙葉纖維素樣品均以纖維素Iβ晶型為主，并且不同方法獲得的煙草纖維素的晶型分布存在明顯差異。采用中性洗滌劑法和酸性洗滌劑法提取所得的纖維素樣品均具有較高相對含量的纖維素Iβ晶體，且中性洗滌劑法＞酸性洗滌劑法；采用酸性水解法和堿液分離法提取所得的纖維素Iβ晶體相對含量均較低，且二者無顯著差異。對于酸性水解法，酸溶液的加入促使樣品發生溶脹，導致介質溶液到達纖維素結晶區，進而對結晶表面造成了一定的破壞［4］，使得纖維素Iβ晶體的相對含量減少。在堿液分離法提取過程中，由于纖維素上的羥基是極性基團，因此堿液是纖維素的良好潤脹劑［28］。堿液中的OH-與纖維素作用時可滲透到纖維內部，破壞纖維素結晶區表面，導致纖維素Iβ晶體的相對含量降低。

進一步分析可知，煙草纖維素樣品中次晶晶體相對含量的大小順序為：堿液分離法＞酸性水解法＞酸性洗滌劑法＞中性洗滌劑法，說明采用堿液分離法、酸性水解法和酸性洗滌劑法提取煙草纖維素，能夠促使纖維素內部少量結晶體發生從有序到無序的轉變。與酸性水解法和堿液分離法相比，酸性洗滌劑法對纖維素的晶型及分布的影響較小，這主要歸因于該法采用的酸溶液濃度較低。綜上可知，中性洗滌劑法對煙草纖維素晶型分布的影響最小。

表3 4種方法所得煙草纖維素樣品的晶型分布Tab.3 Crystal distribution of tobacco cellulose obtained by four extraction methods

2.4 煙草纖維素的結晶度及原纖結構

利用Peakfit 4.0軟件對CP/MAS13C NMR光譜C-4信號峰進行分析，圖3為采用中性洗滌劑法提取所得的烤煙煙葉纖維素樣品的C-4信號峰擬合結果。在有序的C-4區域（δ86～92）采用Lorentzian線形對纖維素 Iα、纖維素 Iα+β、纖維素 Iβ的信號進行擬合；在無序的C-4區域（δ80～86）采用 Gaussian線形對次晶纖維素（PC）、可及基原纖表面（AS）和不可及基原纖表面（IAS）的信號進行擬合。由此分析纖維素不同結晶結構所占比例，并由AS和IAS的相對信號強度計算橫向基原纖尺寸及基原纖聚集束尺寸［29］。表4顯示了不同提取方法所得煙草纖維素樣品的CP/MAS13C NMR光譜C-4信號峰擬合得到的結晶度及原纖結構信息。

圖3 中性洗滌劑法烤煙纖維素樣品的CP/MAS13C NMR光譜C-4信號峰擬合結果Fig.3 Fitting result of C-4 signal peak of13C CP/MAS NMR spectra of flue-cured tobacco cellulose extracted by neutral detergent method

表4顯示，采用中性洗滌劑法提取所得煙草烤煙煙葉纖維素樣品的結晶度最高，為43.8%，與文獻［20］結果一致。采用酸性洗滌劑法、酸性水解法和堿液分離法提取所得纖維素樣品的結晶度明顯低于采用中性洗滌劑法提取所得的纖維素。與中性洗滌劑法相比，酸性洗滌劑法提取所得煙葉纖維素樣品的結晶纖維素含量略有降低，但次晶纖維素含量顯著降低。半纖維素作為纖維素聚集態和三級結構的調節劑，與纖維素有緊密締合作用。采用酸性洗滌劑法提取所得的纖維素樣品中存在半纖維素雜質，可使纖維素分子間的聚集態減弱，進而導致部分次晶纖維素轉化為無定形狀態的纖維素［30］。

進一步分析可知，采用酸性水解法和堿液分離法提取所得的煙葉纖維素樣品中結晶纖維素含量明顯降低。原因是：酸處理使煙草纖維中木質素及半纖維素發生降解，增大了纖維素的可及度，對纖維素的結晶結構造成了一定的破壞［31］，進而導致結晶纖維素含量下降。而NaOH溶液能夠溶脹纖維素，破壞木質素、半纖維素對纖維素的包裹作用，使纖維素結晶區受到破壞［32］，進而導致結晶度下降。綜上可知，與酸性洗滌劑法、酸性水解法和堿液分離法相比，中性洗滌劑法對煙草纖維素的結晶度影響最小。

植物纖維細胞壁中的纖維素分子鏈平行排列形成基原纖，若干根基原纖組成微原纖，微原纖平行地組合在一起形成原纖。有文獻報道［30］，纖維素結構水平上的變化會影響纖維素在化學改性中的活性、纖維素被酶水解的易感性和纖維的強度性能等。由表4可知，纖維素基原纖聚集束尺寸大小順序為：中性洗滌劑法＞酸性水解法＞酸性洗滌劑法＞堿液分離法。4種提取方法中，采用中性洗滌劑法獲得的煙草纖維素純度最高，半纖維素及木質素對基原纖、微原纖的束縛作用減弱，而且對纖維素鏈結構的影響最小，因此采用該方法提取所得的纖維素樣品的基原纖尺寸和基原纖聚集束尺寸均大于其他3種方法。可及基原纖表面是纖維素中能夠提供羥基與帶支鏈的化合物發生化學反應的部分［33］，在纖維素提取過程中，脫除半纖維素和木質素，可及基原纖表面和基原纖聚集束的尺寸均會有所增加。對于由基原纖聚集形成基原纖聚集束的結構，基原纖聚集束尺寸越小，可及基原纖的表面越大，纖維素羥基的反應性和可及度也越高［32］。因此，不同纖維素提取方法會對煙草纖維素原纖結構產生顯著影響。相較于酸性洗滌劑法、酸性水解法和堿液分離法，中性洗滌劑法對煙草纖維素的原纖結構影響最小。

表4 煙草纖維素樣品C-4信號峰擬合的定量信息Tab.4 Quantification results from spectral fitting of tobacco cellulose C-4 signal peak

3 結論

①采用中性洗滌劑法、酸性洗滌劑法、酸性水解法和堿液分離法提取煙葉樣品中的纖維素，其中中性洗滌劑法提取所得煙草纖維素純度最高。②4種方法提取所得煙草纖維素的晶型相同，均以纖維素Iβ晶型為主，但分布存在明顯差異。中性洗滌劑法對煙草纖維素的晶型分布影響最小，酸性洗滌劑法、酸性水解法和堿液分離法能夠促使纖維素內部少量結晶體發生從有序到無序的轉變。中性洗滌劑法獲得烤煙煙葉纖維素樣品的結晶度最高（43.8%），基原纖尺寸（3.4 nm）及基原纖聚集束尺寸（8.9 nm）最大。與其他3種方法相比，中性洗滌劑法對煙草纖維素結晶度和原纖結構的影響最小。③不同提取方法對煙草纖維素的微觀結構有顯著影響。對比其他3種方法，中性洗滌劑法對纖維素微觀結構影響小，提取所得煙草纖維素純度高，因此適合作為煙草纖維素結構研究中纖維素的提取方法。