支氣管肺泡灌洗液SHOX2和RASSF1A基因甲基化檢測在臨床肺癌診斷中的應用

林列坤　盧春生　鄭義　楊菊紅　鄒繼彬　王一娜　譚鴻熙

【摘要】 目的 探討支氣管肺泡灌洗液中人矮小同源盒基因2（SHOX2）、RAS相關區域家族1A（RASSF1A）基因甲基化檢測在肺癌診斷中的應用效果。方法 202例呼吸科住院患者， 其中33例經組織病理診斷肺癌患者， 169例肺部良性結節疾病患者， 收集所有患者支氣管肺泡灌洗液， 然后修飾純化脫氧核糖核酸（DNA）， 進行SHOX2、RASSF1A基因甲基化檢測， 觀察其肺泡灌洗液SHOX2、RASSF1A基因甲基化診斷肺癌敏感性、特異性及診斷準確率， 并比較SHOX2、RASSF1A基因甲基化檢測與細胞學診斷肺癌敏感性， 比較SHOX2聯合RASSF1A基因甲基化與細胞學診斷肺癌病理學四期敏感性。結果 肺泡灌洗液SHOX2基因甲基化診斷敏感性為87.88%， 特異性為89.35%， 診斷準確率為89.11%。肺泡灌洗液RASSF1A基因甲基化診斷敏感性為81.82%， 特異性為93.49%， 診斷準確率為91.58%。SHOX2、RASSF1A基因甲基化診斷肺癌敏感性分別為87.88%（29/33）、81.82%（27/33）， 均高于細胞學的54.55%（18/33）， 差異具有統計學意義（P<0.05）。SHOX2聯合RASSF1A基因甲基化診斷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期肺癌的敏感性分別為75.00%（6/8）、94.12%（16/17）、83.33%（5/6）、100.00%（2/2）， 細胞學診斷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期肺癌的敏感性分別為37.50%（3/8）、52.94%（9/17）、66.67%（4/6）、100.00%（2/2）， SHOX2聯合RASSF1A基因甲基化診斷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期肺癌的敏感性均高于細胞學診斷。其中SHOX2聯合RASSF1A基因甲基化診斷Ⅱ期肺癌的敏感性高于細胞學診斷， 差異具有統計學意義（P<0.05）。結論 支氣管肺泡灌洗液SHOX2和RASSF1A基因甲基化檢測有助于肺癌的早期診斷， 可以作為新型的腫瘤分子標志物。

【關鍵詞】 人矮小同源盒基因2;RAS相關區域家族1A;甲基化;肺癌

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.18.001

Application of detection of SHOX2 and RASSF1A gene methylation in bronchoalveolar lavage fluid for the diagnosis of clinical lung cancer? ?LIN Lie-kun， LU Chun-sheng， ZHENG Yi， et al. University of Chinese Academy of Sciences Shenzhen Hospital， Shenzhen 518106， China

【Abstract】 Objective? ?To discuss the application effect of detection of short stature homobox 2 （SHOX2） and RAS association domain family1A （RASSF1A） gene methylation in bronchoalveolar lavage fluid for the diagnosis of clinical lung cancer. Methods? ?There were 202 hospitalized patients in respiratory department， including 33 cases of lung cancer diagnosed by histopathology and 169 cases of benign pulmonary nodule disease. The bronchoalveolar lavage fluid was collected from all patients， and then modified and purified deoxyribonucleic acid （DNA） was used to detect the methylation of SHOX2 and RASSF1A genes. The sensitivity， specificity and diagnostic accuracy of SHOX2 and RASSF1A gene methylation in alveolar lavage fluid for the diagnosis of lung cancer was observed. The sensitivity of SHOX2， RASSF1A gene methylation detection and cytological diagnosis of lung cancer were compared， and the sensitivity of SHOX2 combined with RASSF1A gene methylation and cytological diagnosis of lung cancer pathological stage 4 were compared. Results? The sensitivity， specificity and accuracy of SHOX2 gene methylation in alveolar lavage fluid were 87.88%， 89.35% and 89.11% respectively. The diagnostic sensitivity， specificity and accuracy of RASSF1A gene methylation in alveolar lavage fluid were 81.82%， 93.49% and 91.58% respectively. The sensitivity of SHOX2 and RASSF1A gene methylation in the diagnosis of lung cancer was 87.88% （29/33） and 81.82% （27/33）， respectively， which were higher than 54.55% （18/33） of cytology （P<0.05）. The sensitivity of SHOX2 combined with RASSF1A gene methylation in the diagnosis of stage Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ and Ⅳ lung cancer was 75.00% （6/8）， 94.12% （16/17）， 83.33% （5/6） and 100.00% （2/2）， respectively. The sensitivity of cytological diagnosis of stage Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ and Ⅳ lung cancer was 37.50% （3/8）， 52.94% （9/17）， 66.67% （4/6） and 100.00% （2/2）， respectively. The sensitivity of SHOX2 combined with RASSF1A gene methylation in the diagnosis of stage Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ lung cancer was higher than that of cytological diagnosis. The sensitivity of SHOX2 combined with RASSF1A gene methylation in the diagnosis of stage Ⅱ lung cancer was higher than that of cytological diagnosis （P<0.05）. Conclusion? ?Detection of SHOX2 and RASSF1A gene methylation in bronchoalveolar lavage fluid is helpful for early diagnosis of lung cancer and can be used as a new molecular marker of cancer.

【Key words】 Short stature homobox 2; RAS association domain family1A; Methylation; Lung cancer

肺癌是全球發病率和死亡率最高的腫瘤之一， 病死率在各類腫瘤中居首位， 我國由于社會人口老齡化加劇， 加之吸煙、大氣污染等因素影響， 我國肺癌的發病問題更加突出[1]。據我國癌癥中心數據報道， 我國每年新發肺癌病例78萬， 其中死亡病例70萬。同時， 由于肺癌早期癥狀不明顯， 患者就診晚， 往往錯過最佳診斷治療時機， 致使肺癌的發病率及病死率均呈上升趨勢[2]。目前臨床檢測肺癌的金標準為病理學檢查， 由于早期肺癌（原位和ⅠA期肺癌）多位于直徑1 cm的結節內， 大多很難取得活體組織標本明確病理診斷。其他診斷方法有X射線、支氣管鏡檢查、螺旋CT和細胞學檢查， 但均存在著較高的漏診率及敏感性較差的特點。由于缺乏有效的篩查和診斷手段， 只有14%的早期肺癌能被診斷， 5年生存率僅為16%， 因此， 早期有效準確的篩查和診斷肺癌， 是臨床面臨的迫切問題。目前， DNA甲基化修飾在腫瘤形成的早期即發生， 是很多腫瘤的里程碑事件[3]。本文通過對支氣管肺泡灌洗液中SHOX2、RASSF1A基因甲基化檢測， 探討SHOX2

和RASSF1A基因甲基化對肺癌診斷的作用， 現報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選擇2018年1月～2019年2月本院202例呼吸科住院患者， 其中33例經組織病理診斷肺癌患者， 男24例， 女9例;年齡42～72歲;包括鱗癌19例， 腺磷癌3例，

腺癌7例， 小細胞癌4例;Ⅰ期8例， Ⅱ期17例， Ⅲ期6例， Ⅳ期2例。169例肺部良性結節疾病患者， 男108例， 女61例;年齡35～79歲;包括支氣管擴張22例， 慢性阻塞性肺疾病38例， 肺炎89例， 肺部占位腫物20例。

1. 2 試劑與儀器 試劑：上海透景生物科技有限公司提供， 嚴格按說明書操作。儀器：ABI7500全自動熒光聚合酶鏈式反應（PCR）儀。

1. 3 研究方法

1. 3. 1 支氣管肺泡灌洗液收集 術前交代患者纖維支氣管鏡檢查目的、注意事項并簽署檢查同意書。先行術前準備， 然后所有患者均予以纖維支氣管鏡經鼻插入， 先檢查左右支氣管， 并根據患者胸部CT顯示的病變部位， 將纖維支氣管鏡遠端楔于病變所在的段支氣管開口處， 彌漫病變則沖洗右中葉或左舌葉， 注入37℃溫生理鹽水， 20 ml/次， 灌洗2次， 以13 kPa負壓盡可能吸盡灌洗液， 收集約10～20 ml肺泡灌洗液， 2000 r/min離心5 min， 棄上清， 留500 μl左右含脫離細胞液體， 再加入500 μl細胞保存液， 混勻， 2000 r/min離心5 min， 棄上清， 余500 μl于2～8℃保存待檢。

1. 3. 2 操作過程 標本采集→DNA提取， 亞硫酸鹽修飾→修飾后DNA純化→實時熒光PCR檢測→分析判斷結果。肺泡灌洗液提取DNA后要求：OD260/OD280：1.6～2.0;DNA濃度≥10 ng/μl。

1. 4 觀察指標 觀察肺泡灌洗液SHOX2、RASSF1A基因甲基化診斷敏感性、特異性及診斷準確率， 并比較SHOX2、RASSF1A基因甲基化檢測與細胞學診斷肺癌敏感性，? 比較SHOX2聯合RASSF1A基因甲基化與細胞學診斷肺癌病理學四期敏感性。

1. 5 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行統計分析。計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 肺泡灌洗液SHOX2基因甲基化檢測情況 肺泡灌洗液SHOX2基因甲基化診斷敏感性為87.88%， 特異性為89.35%， 診斷準確率為89.11%。見表1。

2. 2 肺泡灌洗液RASSF1A基因甲基化檢測情況 肺泡灌洗液RASSF1A基因甲基化診斷敏感性為81.82%， 特異性為93.49%， 診斷準確率為91.58%。見表2。

2. 3 SHOX2、RASSF1A基因甲基化與細胞學診斷肺癌敏感性比較 SHOX2、RASSF1A基因甲基化診斷肺癌敏感性分別為87.88%（29/33）、81.82%（27/33）， 均高于細胞學的54.55%

（18/33）， 差異具有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

圖1 SHOX2、RASSF1A基因甲基化與細胞學診斷肺癌敏感性比較結果柱狀圖

2. 4 SHOX2聯合RASSF1A基因甲基化與細胞學診斷肺癌病理學四期敏感性比較 SHOX2聯合RASSF1A基因甲基

化診斷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期肺癌的敏感性分別為75.00%（6/8）、94.12%（16/17）、83.33%（5/6）、100.00%（2/2）， 細胞學診斷Ⅰ、Ⅱ、

Ⅲ、Ⅳ期肺癌的敏感性分別為37.50%（3/8）、52.94%（9/17）、66.67%（4/6）、100.00%（2/2）， SHOX2聯合RASSF1A基因甲基化診斷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期肺癌的敏感性均高于細胞學診斷。其中SHOX2聯合RASSF1A基因甲基化診斷Ⅱ期肺癌的敏感性高于細胞學診斷， 差異具有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

圖2 SHOX2聯合RASSF1A基因甲基化與細胞學診斷肺癌病理學四期敏感性比較結果柱狀圖

3 討論

SHOX2稱為人矮小同源盒基因2， 是同源盒基因的一員， 其基因序列還有兩個CpG島[4]。研究發現， SHOX2基因在多種實體腫瘤中表達異常， 如肺癌、乳腺癌和腎癌[5， 6]。有研究顯示， 對肺癌患者的癌細胞進行全基因組分析， 并通過重甲基特異性甲基化實驗分析， 發現大部分肺癌患者的肺癌組織SHOX2發生高度甲基化[6]， SHOX2基因的甲基化有可能成為肺癌的早期篩查指標。RASSF1是從最小純合缺失區分離出的一種能與DNA修復蛋白XPA相互作用的基因， 其中一種RASSF1A已被確認為是一種候選腫瘤抑制基因， 在多種實體腫瘤中表達異常， 并參與腫瘤的發生、發展過程[7]， 在肺癌、腎癌等腫瘤中均發現。有研究利用基因組測序法檢測RASSF1基因啟動子CpG位點的甲基化狀態， 發現40%的肺癌組織中標本中RASSF1As基因啟動子CpG位點完全甲基化[4]。

目前， 電子纖維支氣管鏡已成為診斷呼吸道腫瘤的主要工具[8， 9]， 因而進行電子纖維支氣管鏡取樣后的肺泡灌洗液進行基因的甲基化檢測可減少患者的機體損傷， 也是實現肺癌早期診斷， 提高肺癌患者生存率的重要途徑。本文檢測肺泡灌洗液SHOX2和RASSF1A基因甲基化的情況， 肺泡灌洗液SHOX2基因甲基化診斷敏感性為87.88%， 特異性為89.35%， 診斷準確率為89.11%。肺泡灌洗液RASSF1A基因甲基化診斷敏感性為81.82%， 特異性為93.49%， 診斷準確率為91.58%。可見SHOX2和RASSF1A基因甲基化檢測對臨床肺癌均具有診斷價值， 符合相關研究結論 [10， 11]。本研究中， 肺泡灌洗液SHOX2聯合RASSF1A基因甲基化診斷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期肺癌的敏感性分別為75.00%（6/8）、94.12%（16/17）、83.33%（5/6）、100.00%（2/2）， 因為腫瘤細胞特異性形態變化未明顯顯示及病理取樣局限性等原因， 早期檢測肺癌的檢出率受限[12]， 而其客觀性也受病理診斷醫生的主觀意識影響極大， 導致肺癌早期發現早期治療的臨床目標難以實現。據相關其他研究提示， 部分甲基化陽性的肺部結節患者即使現階段病理和影像學不支持肺癌的診斷， 隨訪6個月后， 有部分患者會呈現肺癌的臨床指征[13]。

本研究結果可見， SHOX2基因甲基化能較好的區分肺部良惡性病變， 顯示甲基化的SHOX2不僅可以作為早期檢測的生物指標， 而且SHOX2甲基化可以作為非小細胞肺癌預后的獨立預測指標， 這與目前研究結論相符合[14]。RASSFlA基因調控的靶基因涉及基因轉錄、細胞周期、細胞凋亡等多方面功能， 是一種新發現的腫瘤抑制基因， 在腫瘤發生及發展過程中的作用尤為重要。目前認為， RASSFlA基因表達失活主要與啟動子區異常的高甲基化、雜合性缺失及染色體缺失有關， 是一種較早發現的與肺癌相關的抑癌基因， 能有效提高腺癌檢出， 所以與SHOX2聯合， 能較好提高早期肺癌檢出率， 鑒別肺小結節的良惡性臨床診斷[15]。結合病理細胞學檢查結果顯示， 各肺癌病理類型樣本均有較好的檢出效果， 鱗癌和小細胞肺癌效果更好， 估計是由于小細胞和鱗癌發生部位居中， 纖維支氣管鏡易于到達， 取得脫落細胞數量比周邊組織位置高， 甲基化檢測結果容易被顯示出來。

異常甲基化是很多腫瘤的里程碑事件， 甲基化修飾在腫瘤形成的早期即發生， 同時DNA甲基化的檢測， 在實驗室容易實現開展檢測， 不容易被取樣部位、細胞形態學改變、人員技術水平等因素限制。同時肺泡灌洗液的獲取對患者造成的機體損傷較少， 在臨床易于開展。

總之， 肺泡灌洗液SHOX2和RASSF1A基因甲基化的檢測， 能提高早期肺癌檢出率、彌補細胞學的敏感性和客觀性不足的缺憾， 有助于對早期肺癌的診斷， 是肺癌早期診斷重要的分子標志物。

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[收稿日期：2019-04-11]